BMP-7 siRNA对UVECs与BMSCs共培养体系植入后体内细胞因子表达的影响

发布时间：2017-11-07 10:06

  本文关键词：BMP-7 siRNA对UVECs与BMSCs共培养体系植入后体内细胞因子表达的影响

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【摘要】：[目的]骨缺损的修复是一个受多种生长因子和激素调控的复杂过程,骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein, BMP-7)是骨及骨软骨形成过程的关键性生长因子,能诱导间充质细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞,在骨和软骨的形成中发挥着重要功能。研究发现UVECs和BMSCs共培养可以通过BMP促进成骨分化的同时刺激成骨细胞及成骨前细胞释放血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),而VEGF在促进内皮细胞增殖的同时,也提高了UVECs对BMP的表达,两者相互作用,形成正反馈。本研究应用siRNA技术沉默大鼠UVECs中的BMP-7基因,并与BMSCs联合培养复合部分脱蛋白生物骨移植修复大鼠骨缺损模型,通过增强型绿色荧光蛋白(eGFP)示踪、免疫印迹检测、免疫组织化学等方法检测BMP-7、VEGF、SDF-1表达水平的相关性,继而揭示BMP/VEGF/SDF-1信号通路在细胞归巢中可能的作用机制。[方法](1)原代培养大鼠BMSCs,借助BMSCs贴壁生长的特性进行纯化,在相差显微镜下观察细胞形态变化。将BMSCs传代扩增培养至第3代,流式细胞仪检测CD34、CD2、CD45、CD90表面抗原表达,对BMSCs表型进行鉴定,并行成骨、成脂诱导实验。(2)eGFP质粒转化感受态细菌后,筛选出成功转化的单克隆菌落,扩大培养,转染BMSCs。(3)设计4条针对BMP-7基因的siRNA序列,将所设计好的siRNA序列扩增后插入质粒载体,运用慢病毒转染法将构建的4条干扰基因序列转染到血管内皮细胞内,并采用荧光显微镜观察质粒转染的效果、RT-PCR检测BMP-7 mRNA的表达、WesternBlotting检测血管内皮细胞BMP-7蛋白的表达,筛选出其中最为高效的BMP-7 siRNA序列。(4)将大鼠UVECs培养扩增后与第3代BMSCs按1：1比例复合部分脱蛋白骨建立起联合细胞培养组；将经BMP-7siRNA序列干扰处理的UVECs和第3代BMSCs按1：1比例建立起联合细胞培养干扰组。(5)制作大鼠股骨缺损模型,复合部分脱蛋白骨的各组细胞植入骨缺损部位。(6) Western blotting 和 RT-PCR 行 VEGF, BMP-7, SDF-1检测；免疫组化检测eGFP稳定表达的BMSCs归巢情况；ELISA检测VEGF 及 SDF-1表达水平。[结果](1)采用全骨髓贴壁法分离、纯化大鼠原代BMSCs,经流式鉴定符合骨髓来源干细胞表面标记特性,纯度较高,符合后续实验要求。(2)原代培养的大鼠BMSCs,经成骨、成脂诱导,可向成骨细胞、脂肪细胞分化。(3) eGFP质粒转化以后筛选出成功转化的单克隆菌落,扩大培养,转染大鼠BMSCs,嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下看到明亮清晰的绿色荧光。(4)4条BMP-7干扰质粒分别转染UVECs 72h后提取细胞样品的总RNA, RT-PCR检测筛选出一个干扰效果最强的质粒用于包装慢病毒,结果显示BMP7-3 siRNA的干扰效果最强。(5)对4条质粒干扰后的UVECs 行 Western Blotting检测干扰后的BMP-7蛋白表达情况,BMP7-3 siRNA转染后的细胞BMP-7蛋白表达量明显降低。(6)通过Western-blotting、RT-PCR、ELISA检测发现：实验各组UVECs和BMSCs联合培养体系植入后体内的SDF-1、VEGF、BMP-7表达水平有显著差异。(7)大鼠尾静脉注射标记eGFP的BMSCs后,免疫组化染色发现骨缺损部位的组织切片eGFP染色阳性,证明标记了eGFP的BMSCs有归巢的现象。[结论](1)采用全骨髓贴壁法分离、纯化的大鼠原代BMSCs,经流式鉴定符合骨髓来源干细胞表面标记特性,纯度较高,符合后续实验要求。(2)eGFP慢病毒表达载体转染BMSCs,荧光显微镜下可见大片稳定、明亮的绿色荧光,用该技术也成功运用于将标记有红色荧光蛋白的BMP-7干扰序列转染到大鼠UVECs中。(3)实验中构建的干扰质粒BMP-7-3序列正确有效,干扰效率最高,能够达到实验中干扰脐静脉血管内皮细胞表达BMP-7的要求。(4)尾静脉注射标记了绿色荧光蛋白的BMSCs有向缺损部位归巢的趋势。(5)干扰了BMP-7基因前后的UVECs联合培养体系植入大鼠体内,引起体内SDF-1、VEGF、BMP-7活性因子的表达水平的差异。(6)干扰了BMP-7基因的UVECs联合培养体系植入体内对BMSCs的归巢影响效果不同,BMP/VEGF/SDF-1信号通路可能在细胞归巢机制中起了作用。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R687.3;R318.08

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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2 钱爱平;花国然;戴丽娟;;绿色荧光蛋白在肿瘤活体光学成像中的应用新进展[J];南通大学学报(自然科学版);2010年02期

3 李晓峰;赵劲民;苏伟;崔向荣;罗世兴;马爱国;;大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年10期

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本文编号：1151932