CHAF1A基因在非小细胞肺癌细胞中的功能和分子机制研究

发布时间：2017-12-06 00:11

  本文关键词：CHAF1A基因在非小细胞肺癌细胞中的功能和分子机制研究

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【摘要】：研究目的:1.检测CHAF1A在非小细胞肺癌(NSCLC)组织及癌旁组织中的表达情况,阐明CHAF1A在非小细胞肺癌中的表达;并研究CHAF1A与部分临床参数的关系;2.检测CHAF1A基因在人肺癌细胞株A549、H1299和H1975中的表达;应用siRNA干扰技术进行慢病毒包装并感染目的细胞,敲减CHAF1A基因,干扰CHAF1A基因表达,观察细胞的生长、增殖及凋亡;3.探讨CHAF1A基因敲减后非小细胞肺癌细胞周期的变化;4.检测敲减CHAF1A基因后,非小细胞肺癌细胞下游靶基因表达的变化。探寻具有非小细胞肺癌生长、增殖、转移潜能的预测性生物标志物及其作用机制,为肺癌的诊治探索新的思路。研究方法:1.收集2010年12月至2016年1月在山西医科大学第二附属医院胸外科行手术切除,并且全部经过病理诊断证实为非小细胞肺癌(NSCLC)的患者218例,行免疫组化、免荧光PCR检测,阐明CHAF1A在非小细胞肺癌中的表达;分析CHAF1A与部分临床参数的关系;2.将包装含有CHAF1A基因RNA干扰靶点序列及空载对照慢病毒分别感染H1299细胞,采用倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,观察病毒感染率;Realtime PCR法检测肺癌细胞系H1299细胞CHAF1A的表达变化;3.MTT法、Cellomics细胞计数及细胞克隆形成试验,检测敲减CHAF1A基因后,肺癌H1299细胞的增殖;4.CHAF1A基因敲减后,采用流式细胞技术检测非小细胞肺癌H1299细胞周期的变化及细胞凋亡;5.Western blot技术检测CHAF1A基因敲减后非小细胞肺癌H1299细胞下游靶基因p21、p27、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、Skp2、cyclin D1等的表达水平。研究结果:1.免疫组化结果显示:CHAF1A主要在非小细胞肺癌细胞胞浆和细胞膜中表达,与正常肺组织相比,CHAF1A在非小细胞肺癌组织中表达明显上调;CHAF1A的表达量与非小细胞肺癌患者性别、年龄的关系无统计学意义,而与吸烟与否、肿瘤大小、及肿瘤转移相关;CHAF1A基因在A549、H1299和H1975细胞中mRNA的ΔCt值均小于9.6,表达丰度高;2.定量PCR结果显示:siRNA慢病毒感染后,H1299细胞中CHAF1A基因在mRNA水平的表达量受到抑制(p0.05),敲减效率达到84.7%;3.Cellomics计数表明:CHAF1A基因敲减后细胞数量明显降低(162±10 vs.523±8 cells/field,P0.05);克隆形成实验显示:CHAF1A基因敲减后H1299细胞形成的克隆数显著低于对照组(21±9 vs.84±12 colonies/dish,P0.05;MTT检测结果显示:与对照组相比CHAF1A基因敲减后细胞增殖、生长能力明显下降(P0.05);相比对照组CHAF1A基因敲减后H1299细胞凋亡数增多(P0.05);4.与对照组相比CHAF1A基因敲减后H1299处于G1期的细胞减少(P0.05),处于S期的细胞增多(P0.05),处于G2/M期的细胞显著减少(P0.05)。表明CHAF1A基因敲减后H1299出现了S期向G2/M期的转化减少,细胞阻滞于S期;5.Western blot分析了解CHAF1A基因敲减后下游基因蛋白的变化,结果显示:H1299细胞CHAF1A基因敲减后cyclin D1、CDK2、Skp2表达下调,p21和p27的表达上调。结论:1.和正常组织相比:CHAF1A mRNA、蛋白在非小细胞肺癌组织中表达上调;肺癌细胞株A549、H1299和H1975中CHAF1A基因表达明显。2.CHAF1A过度表达与非小细胞肺癌患者临床病理密切相关,CHAF1A可能是非小细胞肺癌预后的一个重要指标。3.本研究采用siRNA干扰技术,进行慢病毒包装并感染目的细胞,沉默CHAF1A基因,降低H1299细胞mRNA的表达;成功建立了稳定的CHAF1A-siRNA细胞株。4.在非小细胞肺癌H1299,敲减CHAF1A基因使细胞增殖受抑制,克隆形成显著减少;且H1299细胞凋亡明显增加。5.CHAF1A基因敲减后H1299细胞S期向G2/M期的转化减少,细胞阻滞于S期。6.敲减H1299细胞CHAF1A基因后,cyclin D1、CDK2、Skp2表达下调,p21和p27的表达上调,抑制DNA的合成,细胞周期阻滞在S期,限制肺癌细胞的增殖。CHAF1A基因敲减后,H1299细胞的生长、增殖抑制明显,推测CHAF1A是非小细胞肺癌预防和治疗的一个潜在靶点。本研究结果为肺癌的发病机制及治疗靶点的研究提供了新的思路。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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1 刘谈珍;CHAF1A基因在非小细胞肺癌细胞中的功能和分子机制研究[D];山西医科大学;2017年

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本文编号：1256677