凋亡相关蛋白BCL-B在肝纤维化逆转中对肝星状细胞凋亡的调节及机制研究

发布时间：2017-12-07 05:06

  本文关键词：凋亡相关蛋白BCL-B在肝纤维化逆转中对肝星状细胞凋亡的调节及机制研究

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【摘要】：肝纤维化(hepatic fibrosis)是各种病因引起的慢性肝病反复损伤导致的以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积为特征的病理生理过程,严重者会转化为肝硬化或肝癌,预后不良,死亡率高。静态的HSCs富含维生素A,肝脏受到外来刺激时,细胞内维生素A脂滴消失,HSCs转化为活化状态,增殖、迁移能力增强,产生大量细胞外基质,该过程是肝纤维化发生的“中心环节”。有研究表明,去除致病因素后肝纤维化能够发生逆转。肝纤维化逆转的关键是减少胶原分泌,增加其降解。有研究证实活化的HSCs是胶原纤维的主要来源,两项啮齿类动物研究表明,大约50%活化的肝星状细胞在纤维化逆转过程中发生凋亡,而其余的则恢复到静止表型。因此,以活化的HSCs作为靶点进行干预,诱导其凋亡、抑制其增殖及胶原分泌,可逆转肝纤维化。目前,对于治疗肝纤维化尚缺乏有效方法。因此,研究活化的HSC的凋亡机制,对于逆转肝纤维化具有重要意义。细胞凋亡分为内源性凋亡和外源性凋亡,内源性凋亡又称为线粒体途径凋亡,其核心事件是线粒体外膜通透性增加(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP)。MOMP主要是由活化的BH3-only蛋白诱发,该类蛋白可诱导Bcl-2(B cell lymphoma-2)家族两个促凋亡分子BAX(Bcl-2-associated X protein)和/或BAK(Bcl-2 antagonist or killer)在线粒体外膜形成寡聚体,进而形成超分子通道介导线粒体膜间隙的蛋白释放,如细胞色素c(cytochrome c,cyt c),进而触发内源性细胞凋亡。因此,线粒体稳态在细胞凋亡中起重要作用。肝脏是一个高能耗器官,线粒体在能量生成过程中会产生大量的超氧阴离子,这些活性氧成分会损伤线粒体内蛋白、脂类及核酸,而功能蛋白的损伤会增加活性氧的产生、加剧线粒体损伤。当蛋白及DNA损伤累积到一定程度,超过其自身修复能力时,细胞会通过自噬方式对损伤线粒体进行选择性地清除,被称为线粒体自噬(mitophagy)。目前的观点认为,线粒体自噬性清除与细胞凋亡同时存在,但是目前并无文献明确地证明线粒体清除与凋亡的相互关系。hsc中的线粒体清除及其与肝纤维化的关系尚无报道。目前认为bcl-2家族蛋白同时参与了线粒体自噬性清除及细胞凋亡过程,该家族包括6个抗凋亡蛋白(bcl-2、bcl-b、bcl-w、bcl-xl、bfl-1和mcl-1)、许多促凋亡的bh3-only蛋白及其辅因子bax和bak。bcl-2家族蛋白定位于线粒体外膜,通过控制bax/bak寡聚体通道的聚合形成,从而调节线粒体外膜的通透性,启动内源性细胞凋亡。该家族蛋白还可通过结合于自噬调节因子beclin-1阻断自噬小体的形成,bcl-2/beclin1相互作用是细胞自噬的关键调节点。bcl-b(又称为bcl2l10)是最晚发现且研究最少的一个bcl-2家族抗凋亡蛋白,具有其典型结构特征。bcl-b在人体组织中广泛表达,而在hek293t细胞中,可通过与bax结合而抑制凋亡。目前bcl-b在线粒体清除中的作用尚不清楚,并且bcl-b在肝纤维化形成、逆转及hsc凋亡中的表达情况及其功能,未见报道。本课题旨在观察hsc凋亡及肝纤维化逆转过程中凋亡相关蛋白bcl-b表达及线粒体含量的变化情况,阐明bcl-b对hsc凋亡的调控作用及其可能的分子机制。本学位论文由以下三部分组成:第一部分:肝纤维化逆转小鼠模型中原代hsc线粒体含量减少及bcl-b表达下调目的:建立纤维化逆转小鼠模型,观察在纤维化逆转过程中原代hsc的bcl-b表达及线粒体含量变化。方法:应用四氯化碳(carbontetrachloride,ccl4)腹腔注射法诱导小鼠肝纤维化,停药后自发逆转,建立肝纤维化逆转模型。肝组织石蜡切片经he与masson染色检测肝脏病理变化。赖氏法检测血清alt、ast的含量。免疫组织化学法(immunohistochemistry,ihc)和westernblot检测collageni和α-sma的表达。采用原位灌流、梯度密度离心技术分离小鼠原代hscs,经光镜及荧光显微镜鉴定。westernblot检测线粒体蛋白tom20的变化,picogreen检测细胞中线粒体dna总量,评价线粒体清除情况。tunel和流式细胞术(flowcytometry,fcm)检测细胞凋亡。westernblot检测bcl-b表达情况。结果:1成功复制肝纤维化逆转小鼠模型采用ccl4腹腔注射法诱导可逆性的肝纤维化,停止注射后,肝纤维化自发逆转,以此模拟肝纤维化逆转。实验分为5组:对照组(oil)、纤维化组(6w)、恢复1周组(r1w)、恢复2周组(r2w)、恢复4周组(r4w)。oil组小鼠肝脏质地柔软,表面光滑,色泽鲜艳。ccl4给药6w组小鼠肝脏体积稍缩小,质硬,黄褐色,表面细颗粒样,随停药时间延长肝脏表面逐渐恢复光滑柔软。he及masson染色结果显示,oil组小鼠肝板排列整齐,肝小叶结构完整,胶原纤维极少或缺如。6w组小鼠肝脏有出血、坏死,肝细胞空泡、脂肪变性,大量炎细胞浸润,肝板正常排列消失,小叶结构紊乱,胶原纤维组织明显增生沉积。随着停药时间延长,r1w、r2w、r4w组小鼠肝脏坏死逐渐得到改善,肝板排列逐渐恢复,肝细胞脂肪变性减少,胶原纤维组织减少。免疫组织化学结果表明,α-sma和collageni在6w组肝组织中阳性细胞数增多、染色加深,明显高于oil组,r1w组的表达较6w组无明显变化,随停药时间延长,r4w组的表达明显减少。westernblot结果显示,与oil组相比,6w组两种蛋白表达升高,随停药时间延长,两种蛋白的表达逐渐降低,在r4w组表达最低。ccl4腹腔注射6w时alt、ast水平较oil组明显升高,停药后转氨酶水平逐渐下降。以上结果表明肝纤维化逆转模型复制成功。2成功提取小鼠原代hscs应用链酶及Ⅳ型胶原酶原位灌注后,进行梯度密度离心,分离小鼠原代hscs。在波长328nm的倒置荧光显微镜下观察,细胞可自发蓝绿色荧光。显微镜下,刚分离的hscs未活化,呈圆形或椭圆形,体积较大,折光性强。经光镜及荧光显微镜鉴定,所提细胞纯度约为80%,得率约为1×105~1.5×105/小鼠。接种于塑料培养瓶24h后,细胞全部贴壁,本研究取培养3天的原代hsc用于实验,此时细胞仍为静止状态,未被活化;较接近于在体状态。3肝纤维化逆转中原代hscs凋亡增加tunel染色结果显示,oil对照组中hscs的凋亡较明显,6w组中hscs凋亡明显减低,只有极少部分处于凋亡状态。肝纤维化逆转阶段,hscs的凋亡均明显增多,但与停药时间无明显相关性。应用annexin-v/pi双重染色,流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示,与oil组相比,6w组hscs凋亡显著减少,在停药后细胞凋亡增加,于停药2周时细胞凋亡最为明显,以早期凋亡为主,而在停药4周时表现为晚期凋亡为主,细胞总凋亡率与停药时间无明显相关性。表明在肝纤维化逆转中,hscs凋亡增加。4肝纤维化逆转中hscs线粒体含量减少,bcl-b表达下调从原代hscs中提取蛋白,应用westernblot方法检测线粒体膜蛋白tom20的表达变化。结果显示,在6w肝纤维化组中,tom20较oil对照组明显升高。随停药时间延长,tom20的表达逐渐降低,在r4w表达最低,但仍高于oil组水平。表明在肝纤维化时,hscs线粒体含量丰富;而在纤维化逆转过程中,hscs线粒体清除增强,细胞内线粒体含量逐步减少。picogreen荧光染色观察原代hscs中线粒体dna(mtdna)含量。结果显示,在6w组的hscs中,胞浆中荧光亮度较oil组明显增强,且聚集形成团块状,面积较大,表明线粒体增多、融合。而在停药后的r1w组的细胞中,荧光强度明显减弱,且荧光团块明显减小。r2w组较r1w组无明显变化,r4w组中荧光强度虽较前无明显变化,但荧光团块消失,胞浆中荧光较均匀一致。表明在纤维化形成时,hscs中线粒体数量增加且融合聚集;在肝纤维化逆转过程中,线粒体逐渐分散在胞浆中,且数量减少。westernblot结果显示,oil组中bcl-b表达较低,6w组中的表达明显升高,随停药时间延长、肝纤维化逆转,该蛋白的表达逐渐下降,在r4w组中表达接近oil组。表明bcl-b表达与原代hscs的凋亡存在相关性。结论:肝纤维化逆转过程中hscs的凋亡及线粒体清除增加,bcl-b表达下调。第二部分:bcl-b对肝星状细胞凋亡及线粒体清除的影响目的:诱导hsc细胞株lx2凋亡,验证肝纤维化逆转小鼠模型中原代hscs的结果。抑制线粒体清除,明确线粒体清除对hscs凋亡的影响。在lx2中敲低及过表达bcl-b,观察其对lx2凋亡及线粒体清除的影响。方法:应用凋亡诱导剂gtx建立lx2凋亡模型,应用抑制剂csa干预细胞抑制线粒体清除,设计并合成可敲低bcl-b表达的sirna及过表达bcl-b的腺病毒,在lx2中敲低及过表达bcl-b。用westernblot检测bcl-b、线粒体蛋白、凋亡相关蛋白及hsc活化相关蛋白的表达;picogreen检测线粒体dna含量;tunel检测细胞凋亡,反映细胞凋亡、线粒体清除及bcl-b表达水平。结果:1在hsc细胞株中诱导凋亡,线粒体清除增强,bcl-b表达下调应用胶霉毒素(gliotoxin,gtx)诱导hsc细胞株lx2凋亡,在细胞水平模拟肝纤维化逆转。(1)tunel染色检测hscs凋亡率,结果显示,gtx组细胞凋亡率较对照组显著升高。westernblot结果显示,与对照组相比,gtx组活化的凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和活化的内源性凋亡相关蛋白cleaved-caspase9显著升高。同时,gtx组的hsc活化相关蛋白collageni和α-sma的表达明显减少。表明gtx成功诱导了hscs凋亡。(2)并且gtx组的线粒体蛋白tom20较对照组显著降低。picogreen荧光染色法检测mtdna含量,对照组胞浆中绿色荧光强度较高、呈颗粒状,诱导凋亡后,荧光明显减弱且散在分布。说明在凋亡细胞中线粒体总量减少且分散,表明在凋亡的lx2中,线粒体清除明显增强。(3)westernblot结果显示,gtx诱导lx2凋亡后,bcl-b的蛋白表达水平较对照组明显降低。2抑制线粒体清除可抑制hscs凋亡,上调bcl-b表达(1)westernblot结果显示,用线粒体自噬抑制剂环孢菌素a(csa)处理细胞后,线粒体膜蛋白tom20表达升高。picogreen染色结果显示,加入csa后细胞中绿色点状荧光的数量增加,强度升高。表明csa成功抑制了线粒体的清除。(2)tunel染色检测细胞凋亡结果显示,csa干预后,细胞凋亡率降低。westernblot结果显示,与对照组相比,csa刺激后,活化的凋亡相关蛋白cleaved-caspase9及cleaved-caspase3降低。并且hsc活化指标collageni和α-sma的表达显著升高。表明抑制线粒体清除后lx2凋亡减少。(3)westernblot结果显示,csa抑制线粒体清除后,bcl-b升高。3敲低bcl-b促进hscs凋亡及线粒体清除在lx2转染bcl-b特异性的sirna(sibcl-b),并转染无关序列的sirna(sicon)作为对照组,收集蛋白检测bcl-b表达。(1)westernblot结果显示,sibcl-b组较sicon组bcl-b蛋白表达减少了79%,说明bcl-b被成功敲低了。(2)用tunel染色检测细胞凋亡,结果显示sibcl-b组的细胞凋亡率较sicon组明显升高。westernblot结果显示,敲低bcl-b后,与sicon组相比,cleaved-caspase9及cleaved-caspase3蛋白水平升高。同时,collagen和α-sma表达明显下调。说明敲低bcl-b会导致lx2凋亡增加及分泌功能降低。(3)westernblot检测线粒体蛋白tom20结果显示,sibcl-b组中tom20蛋白表达较sicon组显著降低。picogreen结果显示,sibcl-b组细胞中的荧光强度及面积均较sicon组降低,说明mtdna减少。表明敲低bcl-b后,lx2中线粒体数量减少,线粒体清除增加。4过表达bcl-b可抑制lx2凋亡及线粒体清除通过感染腺病毒载体在lx2中过表达bcl-b(adbcl-b),对照组感染空载体腺病毒(adcon)。感染效率可达90%以上。(1)应用westernblot检测bcl-b蛋白表达,结果显示adbcl-b组较adcon组升高约4.7倍,说明bcl-b被成功过表达。(2)tunel染色检测细胞凋亡,结果显示,与adcon组相比,adbcl-b组细胞凋亡率明显降低。westernblot结果显示,较adcon组,adbcl-b组cleaved-caspase9和cleaved-caspase3显著降低。同时,adbcl-b组的collageni和α-sma表达增加。说明过表达bcl-b能抑制lx2凋亡,并促进其活化。(3)对线粒体蛋白tom20的表达进行检测,结果表明,与adcon组相比,adbcl-b组tom20的表达升高。表明过表达bcl-b的细胞中线粒体含量增加,线粒体清除被抑制。结论:抑制线粒体清除导致细胞凋亡减少。bcl-b可抑制lx2凋亡及线粒体清除。第三部分:bcl-b通过抑制细胞线粒体清除抑制hsc凋亡目的:明确bcl-b是否通过抑制线粒体清除调节细胞凋亡。探讨bcl-b抑制线粒体清除的分子机制。方法:在敲低bcl-b的lx2细胞中应用线粒体自噬抑制剂,通过westernblot检测线粒体蛋白表达及picogreen检测mtdna验证线粒体清除被抑制,应用westernblot检测凋亡相关蛋白的表达;tunel法检测细胞凋亡率。敲低或过表达bcl-b,检测细胞中p-parkin的表达变化。应用免疫共沉淀和免疫荧光双染的方法检测lx2细胞中bcl-b与p-parkin是否存在相互结合。结果:1抑制线粒体清除可抑制bcl-b敲低对lx2的作用为明确bcl-b是否通过抑制线粒体清除来抑制细胞凋亡,在敲低bcl-b的细胞中阻断线粒体清除过程。(1)检测线粒体蛋白表达情况,结果显示,sibcl-b+csa组的线粒体膜蛋白tom20表达量较sibcl-b组明显升高。picogreen检测mtdna结果显示,csa干预后较单纯sibcl-b转染组的荧光强度明显增强,荧光颗粒更聚集。说明csa成功抑制了线粒体清除。(2)tunel法检测细胞凋亡情况,结果显示,sibcl-b+csa组较sibcl-b组细胞凋亡率明显降低。与sibcl-b组相比,sibcl-b+csa组的cleased-caspase3和cleased-caspase9水平明显降低;而collageni和α-sma的蛋白表达量升高。表明抑制线粒体清除可抑制bcl-b敲低诱导的lx2凋亡。2bcl-b下调p-parkin水平parkin的磷酸化活化是启动线粒体自噬的关键。westernblot结果显示,敲低bcl-b使p-parkin的水平升高,而过表达bcl-b时,p-parkin水平明显降低。表明bcl-b可抑制线粒体自噬关键蛋白parkin的磷酸化活化。3bcl-b与p-parkin存在相互作用(1)免疫共沉淀结果显示,以兔抗p-parkin(鼠抗bcl-b)对lx2总蛋白进行交互沉淀,并用兔抗igg(鼠抗igg)沉淀作为对照,在igg沉淀组未检测到条带,在p-parkin及bcl-b沉淀组分别检测到bcl-b和p-parkin的条带,说明bcl-b和p-parkin存在相互结合。(2)用红色荧光标记bcl-b,用绿色荧光标记p-parkin,用带蓝色荧光的dapi标记细胞核,进行免疫细胞荧光染色。结果显示,在lx2中,绿色荧光标记的p-parkin分布于细胞质,核周区域较为集中,红色荧光标记的bcl-b在胞浆中呈斑点状分布,两者荧光部分重叠(黄色区域),表明bcl-b与p-parkin存在部分共定位。结论:BCL-B可通过抑制线粒体清除抑制HSC凋亡。在HSC中,BCL-B和p-Parkin蛋白存在相互作用,BCL-B可能通过与p-Parkin结合,抑制其磷酸化活化,从而抑制线粒体自噬性清除。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.2

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本文编号：1261227