沉默miR-769表达对抑制黑色素瘤细胞增殖的实验研究

发布时间：2017-12-07 04:33

  本文关键词：沉默miR-769表达对抑制黑色素瘤细胞增殖的实验研究

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【摘要】：目的确定黑色素瘤中miR-769表达是否异常并筛选其靶基因,研究其具体发病机制及验证沉默miR-769能否抑制黑色素瘤细胞增殖。方法1、实验对象与分组①黑色素瘤患者的病理标本,按病理分期命名为原位组(10例)和转移组(14例);24例正常色素痣病理标本命名为色素痣组。7种黑色素瘤细胞株命名为MM组,人表皮黑色素细胞系命名为PEM组。②黑色素瘤A375细胞株命名为A375组;黑色素瘤细胞株A375分三组分别转染 miR-769 mimics、miR-769-inhibitor 和随机 RNA 序列,命名为 mimics 组,inhibitor 组和 NC 组。③GSK3β野生型质粒和突变型质粒分别转染A375细胞株,命名为WT组和MUT 组。④inhibitor 组分别再转染干扰 RNA GSK3β-siRNA#1 和 GSK3β-siRNA#2,命名为RNA干扰组。2、病理标本和黑色素瘤细胞中miR-769表达黑色素瘤(原位组、转移组)与色素痣组的病理标本;PEM组与MM组细胞株分别进行QRT-PCR试验,测定miR-769表达量并对比。3.miR-769作用机制研究Western Blot检测MM组、inhibitor组和PEM组细胞中GSK3β的表达量;双荧光素酶试验测定mimics组、inhibitor组、MUT组荧光素酶的活性;Western Blot检测inhibitor组和NC组的cyclin D1和c-myc的表达量。4、沉默miR-769研究mimics组,inhibitor组和NC组分别进行QRT-PCR实验、MTT试验、平板细胞克隆实验和BrdU细胞增殖实验。RNA干扰组分别进行Western Blot实验、平板细胞克隆形成实验、锚定非依赖生长分析实验、BrdU细胞增殖实验。5.统计分析采用SPSS21.0统计软件,对数据进行方差分析、t检验、卡方检验。以P0.05作为差异有统计学意义。结果1.QRT-PCR 检测 miR-769 表达黑色素瘤病理标本转移组中miR-769的平均表达水平最高,其次是原位组,色素痣组最低;MM组中miR-769的平均表达水平较PEM组高。2.miR-769作用机制Western Blot:inhibitor组GSK3β的表达量最高,其次是NC组,A375组几乎没有。双荧光素酶报告:mimics组的细胞荧光素酶活性降低,inhibitor组升高,MUT组的不变。Western Blot:A375组中cyclin D1和c-myc表达明显提高;inhibitor组表达下降。3.沉默 miR-769QRT-PCR:mimics组miR-769表达最高,其次是NC组,inhibitor组最低;MTT试验:mimics组OD值最高,NC组其次,inhibitor组最低;平板细胞克隆实验中mimics组细胞克隆形成率最高,NC组其次,inhibitor组最低;BrdU细胞增殖实验中mimics组S期细胞比例最高,NC组其次,inhibitor组最低。Western Blot:RNA干扰组GSK3β的蛋白条带几乎没有;平板细胞克隆结果:RNA干扰组中细胞克隆形成率显著升高;锚定非依赖生长分析实验:RNA干扰组中直径大于0.1mm集落数目显著高于NC组;BrdU细胞增殖实验:RNA干扰组中S期细胞比例明显高于NC组。结论:1、miR-769过表达与黑色素瘤发病密切相关。2.黑色素瘤细胞中miR-769下调靶向基因GSK3β表达,激活cyclin D1和c-myc,从而促进黑色素瘤细胞的增殖。3.沉默miR-769表达可上调GSK3β表达,进而抑制黑色素瘤细胞的增殖。小干扰RNA可下调GSK3β的表达,抑制这一过程。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.5

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