结核分枝杆菌表观遗传与耐药新机理研究

发布时间：2017-12-07 17:25

  本文关键词：结核分枝杆菌表观遗传与耐药新机理研究

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【摘要】：结核病,一种古老的疾病,仍然是威胁人类健康的重要传染性疾病之一,其致病菌是结核分枝杆菌。全世界大约有三分之一的人潜伏性患有结核病。据2016全球结核病报告统计,2015年,全世界新发结核病数量约为1040万例,其中中国患者约占总比例人数的7.7%,另外每年大约有140万结核病患者死亡。结核病难以治愈的主要原因是由于其具有三大“武器”:毒力、持留性和抗生素耐受。蛋白质赖氨酸乙酰化是一种在真核生物和原核生物中是广泛存在的,由赖氨酸乙酰化酶和去乙酰化酶所催化的可逆的翻译后修饰,它在生物体的多种生理途径如转录、翻译、代谢、蛋白质稳定性、细胞分裂或细胞死亡、信号转导等扮演着重要角色。赖氨酸戊二酰化是最近刚发现的一种新型的蛋白质翻译后修饰,其在调控代谢途径中发挥着重要作用。s RNAs(small RNA)是一种长度为50-500nt左右的转录产物,其主要分为两种类型:顺式编码sRNA和反式编码sRNA,它们均可通过影响转录、翻译、m RNA稳定性等来发挥调控作用。sRNAs已经被证明在细菌各种生理途径如糖或氮代谢、铁平衡、抗生素耐受中扮演着重要角色。因此,赖氨酸乙酰化修饰、戊二酰化和sRNAs极有可能在结核分枝杆菌的毒力和抗生素耐受中发挥一定作用。基于以上情况,本论文主要从以下几个部分进行工作研究:首先我们利用免疫亲和富集和高灵敏度的质谱联用方法,对结核分枝杆菌H37Rv的乙酰化蛋白质和乙酰化为点进行了检测,总共鉴定到658个乙酰化蛋白质和1128个乙酰化位点,并利用GO富集分析等生物信息学方法对这些蛋白质进行了初步分析,发现赖氨酸乙酰化修饰几乎涉及到结核分枝杆菌细胞所有生理途径,可能具有广泛的影响性,其中大量乙酰化的蛋白质是与代谢途径相关的。利用软件motif-x对结核菌所有乙酰化的蛋白质底物进行了分析,鉴定出了6个呈现不同丰度的保守基序。通过数据挖掘和文献收集,我们从中选取了与结核分枝杆菌毒力、持留、抗生素耐受有密切联系的异柠檬酸裂解酶作为下一步的研究对象,在耻垢分枝杆菌中表达纯化结核菌异柠檬酸裂解酶并通过质谱鉴定发现其可以在322位赖氨酸(k)乙酰化,这与组学数据鉴定的位点相一致。此外,定点突变乙酰化位点测定酶活性,发现体外模拟乙酰化过程的k322q突变蛋白的酶活性会大幅度降低,表明乙酰化会抑制异柠檬酸裂解酶的活性,并影响细菌对抗生素的耐受。接着,我们采用生物信息学的方法,对结核分枝杆菌中的已鉴定的和功能未知的乙酰化酶进行了系统性分析,最终发现47个假定的或已鉴定的乙酰化酶,对其进行功能分类发现大多数乙酰化酶归属于中心代谢和呼吸类。此外通过blast等一系列生物信息学方法,发现一些乙酰化酶在机会性和非致病性分枝杆菌中存在同源蛋白质。与结核分枝杆菌毒力基因数据比较分析,发现有两个乙酰化酶可能与毒力相关。交叉比较了乙酰化酶数据和已报道的其他ptms组学数据,结果表明只有一种乙酰化酶,rv2215,既可以被乙酰化也可以被琥珀酰化和戊二酰基化,也发现一种乙酰化酶可以被乙酰化,琥珀酰化和戊二酰基化修饰,此外,rt-pcr方法证明了许多乙酰化酶可能与邻近基因组成了同一操纵子。为了进一步探究赖氨酸乙酰化修饰的作用,我们以耻垢分枝杆菌作为模式生物和研究对象,利用免疫亲和富集和高灵敏度的质谱联用方法,对其乙酰化蛋白质和乙酰化位点分布进行了检测,总共鉴定了345个乙酰化蛋白质和620个乙酰化位点。生物信息学方法分析发现乙酰化蛋白质具有广泛的生物学功能和定位,鉴定了可能存在的6种乙酰化基序(kach,kacy,kacf和f*kac),并构建了耻垢分枝杆菌第一张乙酰化蛋白质-蛋白质相互作用网络图谱,同时也发现许多参与中心代谢的蛋白质都被乙酰化。此外,我们构建了乙酰化酶rv0998的同源蛋白质msmeg_5458的基因缺失菌株,发现该蛋白可以调节蛋白质乙酰化状态进而影响对抗生素异烟肼和十二烷基磺酸钠敏感性;气相色谱-质谱结果显示赖氨酸乙酰化可以改变耻垢分枝杆菌大多数脂肪酸含量;通过差异蛋白质乙酰化组学方法发现了可能为msemg_5458的102个蛋白质乙酰化底物,在这些底物中包括参与分枝菌酸合成途径与异烟肼耐受相关的inha蛋白质;定点突变方法和spottest实验结果显示inha的乙酰化不是导致缺失菌株对异烟肼耐受的原因;最后我们通过测定野生型菌株和缺失菌株中nad+和nadh含量,发现nad+/nadh比列的下调是导致缺失菌株对异烟肼耐受的原因。目前关于细菌中戊二酰化研究,仅仅集中在大肠杆菌上,对于致病菌尤其是结核分枝杆菌的戊二酰化组学图谱还没有研究。为了更好理解结核分枝杆菌戊二酰化分布情况,我们利用抗赖氨酸戊二酰化抗体的免疫亲和富集以及质谱联合方法,鉴定了结核分枝杆菌中存在24个戊二酰化蛋白和41个戊二酰化位点,其中有许多戊二酰化蛋白在细菌中是第一次报道。我们发现戊二酰化蛋白参与多种生物学途径,如代谢,应激反应。此外,与结核分枝杆菌中其他翻译后修饰组学数据比较分析,发现有15个蛋白既可以被戊二酰化又可以被乙酰化和琥珀酰化。值得注意的是,一些与应激反应相关的包括HspX在内的蛋白质被戊二酰基化。最后本文研究了铁稳态主要调控元件IdeR蛋白质的上游调控sRNAs和下游所调控的靶标sRNAs。首先通过文献搜集和数据挖掘,发现了一个可能调控IdeR的s RNA,由IdeR编码序列的反义链所编码形成的顺式编码sRNA,ncRv2711c,并通过其特异性的DIG标记探针进行了Northern blot鉴定;随后我们发展了一种可以快速、简单、经济的鉴定sRNAs 5’末端和3’末端的新方法RJEM,并以已知5’末端和3’末端的大肠杆菌RyhB和结核分枝杆菌Mcr7 sRNAs为研究对象,对该方法的准确性进行了验证,并用该方法鉴定了ncRv2711c的5’末端和3’末端,确定了ncRv2711c的准确长度;我们构建了可以在四环素诱导下过表达ncRv2711c的重组结核分枝杆菌(ST377);通过测定其在不同培养基条件下的生长曲线,发现过表达ncRv2711c可以导致ST377在高铁环境培养时生长明显受到抑制,而在低铁环境培养时生长无多大影响;Western blot结果显示过表达ncRv2711c可以导致IdeR蛋白质的水平下降,定量PCR结果显示过表达ncRv2711c可以导致铁储存蛋白质bfrB的转录水平的下降,铁转运蛋白质MbtB转录水平上升;通过对低铁和高铁培养条件下的结核分枝杆菌全RNA测序,最终鉴定了85个和铁应答反应相关的差异性sRNAs;生物信息学分析显示这些s RNAs的长度大多数位于50-500nt,GC含量位于55%-70%左右;通过启动子基序分析和EMSA实验验证发现了IdeR蛋白质可以结合到ncRv0281c的启动子区域上,测定野生型和缺失IdeR耻垢分枝杆菌中ncRv0281c启动子活性,发现IdeR可能正调控ncRv0281c的表达。但是Rv0281c蛋白质与结核分枝杆菌铁代谢之间的关系还有待进一步实验验证。总之,本文绘制了结核分枝杆菌乙酰化蛋白质图谱,确定了乙酰化酶在抗生素耐受中发挥作用的事实,并拓展了结核分枝杆菌sRNAs在铁代谢中的调控通路的认识。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378.911
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本文编号：1263195