弓形虫入侵转化过程中宿主Rac1及虫体DNA甲基化的作用研究

发布时间：2017-12-07 21:06

  本文关键词：弓形虫入侵转化过程中宿主Rac1及虫体DNA甲基化的作用研究

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【摘要】：背景:弓形虫是一种机会性致病原虫,人和其他温血动物均可通过多种途径被感染。弓形虫入侵宿主细胞的过程主要包括粘附细胞膜,纳虫泡(PV)的形成等。中间宿主感染后,弓形虫可实现速殖子向缓殖子的转化,形成慢性感染;当宿主免疫力低下时,缓殖子则会向速殖子转化,引起急性发病。目前关于弓形虫入侵及速、缓殖子相互转化机制尚不完全清楚。宿主Rac1在细胞骨架重组中扮演着重要的角色,以往研究发现弓形虫入侵宿主细胞过程中Rac1在纳虫泡膜(PVM)上存在聚集现象。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式,主要参与物种表型的可塑性和适应性。本研究着重探讨弓形虫入侵转化过程中宿主Rac1及虫体DNA甲基化的作用。方法:Rac1抑制剂(NSC23766)处理HFF细胞后用RH-GHP-SAG1株弓形虫感染细胞,观察统计弓形虫入侵效率。抑制剂处理细胞后观察宿主actin在弓形虫感染时的重排现象。宿主Rac1与弓形虫ROP2共定位现象观察。COS-7细胞中过表达CFP-Rac1-WT后感染弓形虫,在不同的时间点统计Rac1阳性PVs。Western blot检测弓形虫感染后不同时间点Rac1磷酸化水平变化。NSC23766处理细胞后观察抑制剂对弓形虫增殖的影响。检测核蛋白DNA甲基转移酶(DNMT)活性。体外克隆表达弓形虫DNMT基因Tgdnmta和Tgdnmtb,纯化重组表达的TgDNMTa和TgDNMTb并进行DNMT活性检测。qPCR检测两个基因在速、缓殖子的表达水平。弓形虫速、缓殖子全基因组DNA甲基化高通量亚硫酸氢盐测序。特定位点测序结果验证。差异甲基化基因的生物信息学分析。DNMT抑制剂(5-AzaC)处理弓形虫后,观察5-AzaC对其入侵增殖的影响。构建弓形虫DNMTs敲除虫株。结果:NSC23766处理细胞后弓形虫的入侵效率显著低于正常组(p0.05)。正常细胞感染弓形虫时细胞骨架重组更活跃。宿主Rac1与弓形虫ROP2在PVM上共定位。弓形虫一旦开始入侵便会招募Rac1向PVM聚集,随着入侵时间的延长,Rac1会从PVM上消失。宿主细胞Rac1磷酸化水平随着弓形虫感染时间的增加(0-6小时)而增强。长期用NSC23766处理细胞会抑制弓形虫在PV增殖(p0.05)。弓形虫存在两个DNMT蛋白:TgDNMTa和TgDNMTb。重组表达的TgDNMTa和TgDNMTb蛋白均具有DNMT活性,两个基因在缓殖子转录水平均高于速殖子。缓殖子甲基化位点多于速殖子。速、缓殖子存在差异DNA甲基化的基因主要参与一些基础的能量代谢过程并且和寄生虫抵抗宿主免疫等密切相关。5-AzaC处理弓形虫能够抑制弓形虫DNA甲基化的发生,进而抑制速殖子在PV增殖(p0.05)。结论:Rac1调节宿主细胞骨架重组从而有利于弓形虫入侵。弓形虫基因组存在DNA甲基化现象,且缓殖子甲基化水平高于速殖子,DNA甲基化有可能在弓形虫速、缓殖子相互转化过程中起作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R382.5

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本文编号：1263823