生物传感新方法对慢性粒细胞白血病K562细胞和microRNA-21的检测研究

发布时间：2017-12-07 21:04

  本文关键词：生物传感新方法对慢性粒细胞白血病K562细胞和microRNA-21的检测研究

  更多相关文章： 慢性粒细胞白血病 K562细胞 核酸适配体 电化学检测 细胞传感器 适体传感器 发夹堆叠循环 逻辑门 SPR传感器 miRNA-21

【摘要】：随着对慢性粒细胞白血病(CML)研究的日益深入,大量新的研究方法、诊断标志物不断被发现,这些发现为该疾病的早期诊断、治疗和预后提供了新的理论依据和技术支持,也为该疾病逐步推广的个体化治疗带来了希望。本研究整合了分子生物学、细胞生物学、生物分析化学等技术,原创性地发展了简单、实用的电化学传感器分析方法,实现了对慢性粒细胞白血病K562细胞的直接、快速、原位、超灵敏定量检测;并设计了基于高性能发卡堆叠循环(HSC)和逻辑门的表面等离子共振传感器,实现了对CML中高表达的miRNA-21的快速、准确和灵敏地检测。本研究主要包括以下两个部分:1.电化学适体细胞传感器直接快速检测慢性粒细胞白血病K562细胞本研究整合核酸适配体相关技术、细胞生物学相关技术、生物素-亲和素系统、碱性磷酸酶联级信号放大策略以及电化学传感检测技术,发展了一种用于慢性粒细胞白血病K562细胞的快速、超灵敏电化学传感检测新方法。核酸适体被标记在金电极表面,适体作为新兴的连接配体能够特异的与K562细胞表面受体相结合,进而将细胞固定在金电极表面,通过细胞表面多聚糖抗体-生物素标记的伴刀豆蛋白A(bio-ConA)将生物素-亲和素系统引入检测中,继而将亲和素标记的碱性磷酸酶引入检测系统作为信号识别元件,碱性磷酸酶催化底物α-NP产生电信号,可将细胞识别事件转化为生物酶的联级电信号放大并用于电化学检测。该细胞传感器建立的基于碱性磷酸酶联级信号放大策略检测K562细胞时,非特异性吸附较少,背景信号较低,信号放大能力明显增加。本方法能够对79 cells/m L的生物样本产生响应信号;其线性检测范围为102-107 cells/m L,线性范围较宽,可达六个数量级;并且适用于复杂的静脉血样本中K562细胞的定量检测。本研究所提出的联级信号放大策略有望成为检测CML K562细胞的有力工具,也有望应用于对其它相关肿瘤细胞的检测,在细胞生物学研究中发挥重要作用。2.基于高性能发卡堆叠循环和逻辑门的表面等离子共振传感器检测慢性粒细胞白血病潜在标志物Micro RNA-21研究表明miRNA-21在慢性粒细胞白血病患者细胞中有高表达。miRNA-21能够增加CML K562细胞迁移和减少细胞凋亡,其反义寡核苷酸链能够抑制CML K562细胞迁移,促进K562细胞凋亡,上调肿瘤抑制基因PDCD4的表达。总之,miRNA-21在CML的发生发展过程中起着重要作用,可作为该疾病潜在的检测标志物。本研究设计了基于高性能发卡堆叠循环(HSC)和逻辑门的表面等离子共振传感器检测miRNA-21。HSC是基于核酸分子杂交的动力学控制机制的循环体系。在HSC系统中,设计了三个亚稳态DNA发卡结构,正常情况下这三个发卡结构内部有碱基互补配对,但三者之间没有相互反应。当加入靶物质(DNA、RNA、miRNA)催化剂时,短单链寡核苷酸与一个发卡上的立足点(toehold)序列相互作用,产生类似催化剂的作用,导致链置换级联反应,形成分支复合物并诱导催化再循环。这种循环应用于传感器中可产生信号放大效应,对于增强传感器灵敏度和降低基质效应具有重大影响。在本研究中,为了减少检测背景,我们还引入了在发卡特定区域中取代两个核苷酸的新策略,称之为“环域取代”。通过这些改进,循环体系的信噪比(S/B)比最初的设计提高了6倍。最终,这种高性能循环技术成功应用于检测低至1.5 pM的miRNA-21。通过设计不同的DNA输入线,也可以激活“INHIBIT”、“AND”逻辑门,实现基于SPR平台的信号输出。这些研究成果不仅为HSC循环体系的开发提供了设计指导,而且通过检测相关miRNA,为疾病诊断提供了一个简单、无标记和无酶的平台。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R733.72

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本文编号：1263799