基于生物电纺技术的组织工程骨构建

发布时间：2017-12-07 20:20

  本文关键词：基于生物电纺技术的组织工程骨构建

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【摘要】：第一部分同轴电纺P3HB4HB/GE+PVA复合支架制备及其生物相容性的研究目的:制备不同配比浓度的P3HB4HB/GE+PVA同轴电纺支架,测试其综合性能,优选性能优良的组织工程支架。方法:以6%w/v P3HB4HB溶液为芯层溶液,以8%w/v的GE+PVA混合溶液为壳层溶液,每10ml壳层混合溶液中GE和PVA的质量分别为0.6g:0.2g(A组);0.4g:0.4g(B组);0.2g:0.6g(C组)。制备同轴静电纺丝支架,检测5组支架支架形貌和表征、孔径、孔隙率、接触角、拉伸力学性能。取第4代h ASCs接种于各组支架上,CCK8检测细胞增殖情况;细胞与支架复合后,成骨和成软骨诱导培养14天,采用茜素红、碱性磷酸酶、番红O及阿利新蓝染色验证支架上干细胞分化潜能。结果:C组孔径、孔隙率显著高于A、B组(P0.01)。力学检查,纤维支架拉伸强度、拉伸弹性模量A组B组C组,断裂标称应变A组B组C组。CCK8检测示,第9天时C组细胞增殖率显著高于A、B组(P0.01)。细胞支架共培养,扫描电镜观察示C组支架孔径大小较一致,相互连通,细胞在支架内部生长良好,伸展充分,基质分泌多;A、B组支架孔径较小,支架表面呈串珠及蜂窝状覆盖物,纤维直径大小不一,孔隙间相通性差,其中A组细胞生长较少;扫描电镜示支架内部C组细胞数量明显多于A、B组。DAPI免疫荧光染色,A、B、C组见细胞附着于纤维上,C组细胞量大于A、B组,B组细胞量大于A组。经过诱导培养,成骨和成软骨特异性染色C组均强于A、B两组。结论:GE:PVA质量比为2:6时,同轴电纺制备的P3HB4HB/GE+PVA纤维支架具有良好生物相容性和有一定力学强度,是一种性能优良的组织工程支架。第二部分h ASCs复合P3HB4HB/GE+PVA纳米仿生纤维体内异位成骨能力的研究目的:探讨人脂肪间充质干细胞复合P3HB4HB/GE+PVA纳米仿生纤维三维支架体外成骨诱导后植入裸鼠体内异位构建组织工程化骨的能力。方法:利用同轴电纺技术制作P3HB4HB/GE+PVA纳米仿生三维支架,取第4代人脂肪间充质干细胞以2×107/ml的密度接种在纳米三维支架上,分诱导组和未诱导组。扫描电镜和投射电镜观察三维支架的微观结构,吖啶橙染色和DAPI染色观察细胞在三维支架上的生长情况。诱导组细胞/支架复合物在成骨诱导培养基中体外培养2周后植入裸鼠背部皮下,未诱导组细胞-支架复合物在含10%新生牛血清的高糖DMEM培养基中体外培养2周后植入裸鼠背部皮下。观察裸鼠皮下种植的细胞-支架复合物形态变化。分别于8周和16周取材行HE染色、茜素红染色、Von Kossa染色、马松三色染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色。结果:同轴电纺制备的纳米仿生三维支架表现出良好的亲水性和细胞吸附性。扫描电镜见纳米纤维连续、均一、光滑,细胞在纤维上粘附、生长。投射电镜可见纳米纤维的芯壳结构。吖啶橙染色和DAPI染色均显示细胞在支架上生长旺盛。细胞-支架复合物植入裸鼠体内,裸鼠生存状态良好,诱导组复合物大小形态基本保持原状,质地变硬;未诱导组逐渐缩小至完全降解。8周和16周时诱导组HE染色、茜素红染色、Von Kossa染色、马松三色染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色检测均呈阳性。未诱导组均呈阴性。结论:人脂肪间充质干细胞复合P34HB/PVA纳米仿生纤维经体外诱导后初步具有在裸鼠体内异位构建组织工程化骨的能力。第三部分生物电纺P3HB4HB/(GE+PVA)-h ASCs复合物体内异位成骨能力的研究目的:利用同轴静电纺织技术,一次成型细胞-支架复合物。探讨P3HB4HB/(GE+PVA)-h ASCs复合物在体内构建组织工程化骨的能力。方法:采用同轴电纺技术制备出芯为P3HB4HB,壳为GE、PVA及h ASCs混合液的一次成型复合物,分诱导组和未诱导组。扫描电镜、投射电镜、吖啶橙染色、DAPI染色观察三维支架微观结构及细胞与材料的复合情况。诱导组细胞-支架复合体外成骨诱导培养2周后植入裸鼠背部皮下,未诱导组细胞-支架复合物体外不诱导培养2周后植入裸鼠背部皮下。观察裸鼠皮下种植的细胞/支架复合物形态变化。分别于8周和16周取材行HE染色、茜素红染色、Von Kossa染色、马松三色染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、Western-blot检测Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素表达。结果:扫描电镜见细胞在纤维上粘附和生长,并分泌大量基质。吖啶橙染色和DAPI染色均显示细胞大量的、均匀的种植在支架。细胞-支架复合物植入裸鼠体内,裸鼠生存状态良好,诱导组复合物大小形态基本保持原状,质地变硬;未诱导组逐渐缩小至完全降解。8周和16周时诱导组HE染色、茜素红染色、Von Kossa染色、马松三色染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色检测均呈阳性。未诱导组均呈阴性。Western-blot检测诱导组植入裸鼠体内8周部分表达Ⅰ型胶原蛋白和低表达骨钙素;16周高表达Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素表达。未诱导组植入裸鼠体内16周不表达Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素。结论:同轴电纺一次成型构建的P3HB4HB/(GE+PVA)-h ASCs复合物,经体外诱导后初步具有在裸鼠体内异位构建组织工程化骨的能力。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R318.08

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本文编号：1263664