营养饥饿增加卵巢癌细胞对BH3模拟物凋亡敏感性及机制研究

发布时间：2017-12-07 19:24

  本文关键词：营养饥饿增加卵巢癌细胞对BH3模拟物凋亡敏感性及机制研究

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【摘要】：卵巢癌是临床上最常见的妇科肿瘤,致死率较高。临床上化疗耐药引起的抗肿瘤疗效不理想,是肿瘤复发导致死亡的主要原因。卵巢癌细胞Bcl-2(B-cell lymphoma 2)家族抗凋亡蛋白等致癌基因的活化是肿瘤规避凋亡的机制之一。因此,靶向Bcl-2的小分子抑制剂的出现为卵巢癌临床治疗提供一个新的方向。同时,为探究Bcl-2家族在凋亡中的作用提供了工具。ABT737是模拟“BH3结构域”的Bcl-2小分子抑制剂,但对高表达Mcl-1(myeloid cell leukemia 1)的肿瘤疗效差以及副作用等限制了ABT737的杀伤作用。如何提高ABT737疗效并减少副作用成为我们目前亟待解决的问题。近期人们发现肿瘤代谢在肿瘤治疗与预后过程普遍发挥重要作用。已知肿瘤代谢与细胞死亡在多种水平上紧密关联。学者发现通过限制营养等方法改变细胞代谢环境可能会增加肿瘤细胞对化疗药物等抗癌剂的敏感性,还会引起Bcl-2家族蛋白发生改变,提示Bcl-2家族与肿瘤代谢关系密切。但是营养与Bcl-2抗凋亡蛋白之间的关系及调控机制尚不十分清楚。线粒体作为主要代谢功能的细胞器在调控细胞死亡方面起到纽带作用。而且线粒体是高度动态变化的细胞器,处于不断的分裂与融合的动态平衡。线粒体动力学对代谢应激特别敏感,当营养饥饿时,线粒体形态常常发生适应性改变。此外,线粒体的分裂融合还受到细胞信号转导和应激应答通路的严密调控。有研究显示Bcl-2家族蛋白参与调控线粒体的分裂融合平衡。因此,我们推测Bcl-2家族蛋白与肿瘤代谢可能通过调控线粒体动力学决定细胞的生存与死亡。本研究采用Earle's平衡盐溶液(EBSS)模拟营养饥饿,以ABT737作为抑制Bcl-2/Bcl-x L/Bcl-W的工具,通过EBSS与ABT737共同作用人卵巢癌细胞SKOV3,以葡萄糖模拟营养补充,研究肿瘤糖酵解在人卵巢癌细胞耐受营养饥饿中的作用,结合线粒体动力学的变化,分析营养饥饿影响Bcl-2小分子抑制剂凋亡敏感性的机制。方法:根据实验设计,设立对照组、实验组,其中实验组包括单加组与合加组,分别进行以下实验。(1)MTT法检测人卵巢癌细胞SKOV3生存率。倒置显微镜观察SKOV3细胞形态变化。Hochest 33342染色观察凋亡细胞核;TUNEL染色和流式细胞术定量检测细胞凋亡。(2)DCFH-DA染色检测细胞ROS(reactive oxygen species)水平。JC-1染色与流式细胞术定量分析线粒体膜电势变化。(3)检测ATP生成变化;检测乳酸分泌量的变化。(4)实时荧光定量PCR检测有氧糖酵解相关基因GLUT1、LDHA、HKII表达变化。(5)激光共聚焦显微镜观察细胞核及线粒体形态变化;免疫荧光染色与激光共聚焦联合检测线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1在线粒体上表达变化。(6)依据Bcl-2基因序列(Gen Bank:NM_000633),构建p GPU6/GFP/Neo/RNAi重组质粒,命名为Si-Bcl-2,通过荧光观察与Western blot方法进行技术验证。(7)提取细胞总蛋白,利用Western blot方法有氧糖酵解相关蛋白HKII、PDK1与PDHB表达变化,线粒体分裂与融合蛋白OPA1与Mfn2、Drp1与Fis1表达变化,以及Bcl-2家族蛋白表达变化。提取细胞线粒体组分蛋白,利用Western blot方法检测线粒体分裂融合蛋白与Bcl-2家族Bak、Bax表达变化。提取细胞胞浆组分蛋白,利用Western blot方法检测胞浆中Omi/Htr A2、细胞色素C、Cleaved-Caspase3表达变化。结果:1.MTT结果显示ABT737联合EBSS能够有效地降低SKOV3细胞的生存率,相同浓度的ABT737或EBSS仅能有限的降低SKOV3细胞的生存率,补充葡萄糖减轻ABT737联合EBSS诱导的生存率降低。倒置显微镜观察发现ABT737联合EBSS处理组较之EBSS单加组的细胞密度降低,细胞收缩变圆。而无糖DMEM单加组与ABT737联合无糖DMEM合加组结果显示,细胞都有明显收缩变圆现象,未见明显差异。2.Hochest 33342染色观察ABT737联合EBSS处理引起SKOV3细胞核固缩、碎裂,合加补糖组细胞核固缩碎裂显著减少。TUNEL染色和流式细胞术检测也显示ABT737联合EBSS处理组细胞凋亡数量明显增加,补充葡萄糖后细胞凋亡数量明显减少。3.DCFH-DA染色和JC-1染色显示,ABT737联合EBSS处理引起SKOV3细胞ROS积累、线粒体膜电势下降,并诱导Omi/Htr A2、细胞色素C从线粒体释放;补充葡萄糖后ROS生成减少和线粒体膜电势得以恢复,Omi/Htr A2、细胞色素C释放降低。4.ABT737联合EBSS处理能使ATP合成和乳酸分泌降低,补糖后会明显增加。EBSS可以促进糖酵解相关GLUT1、LDHA、HKII、PDK1基因或蛋白的表达,抑制PDHB的蛋白表达。联用ABT737能够不同程度的下调GLUT1、LDHA、HKII、PDK1基因或蛋白表达,上调PDHB的蛋白表达。补充葡萄糖后糖酵解相关基因或蛋白表达有所恢复。5.EBSS处理SKOV3细胞诱导线粒体融合增加。联合ABT737能够促进线粒体分裂,且在24 h时发现细胞核凹陷变形。补充葡萄糖可以重建线粒体分裂融合平衡,减轻线粒体分裂。6.ABT737与EBSS联用发现融合蛋白OPA1和Mfn2表达显著下调、分裂蛋白Drp1和Fis1表达上调,而且激光共聚焦显微镜观察发现ABT737联合EBSS能够增加Drp1移位于线粒体上,以及Fis1在线粒体上表达增多,补充葡萄糖后定位于线粒体上的分裂蛋白减少。7.ABT737联合EBSS处理SKOV3细胞,能够显著干扰Bcl-2家族蛋白表达,下调抗凋亡蛋白Mcl-1表达的同时上调BH3-only蛋白Noxa与促凋亡蛋白Bax/Bak的表达。补充葡萄糖可以减轻对Bcl-2家族蛋白的干扰。8.RNAi Bcl-2联合EBSS可以显著降低人卵巢癌细胞的生存率;同时下调抗凋亡蛋白Mcl-1表达,上调BH3-only蛋白Noxa与促凋亡蛋白Bax/Bak的表达。并且下调线粒体融合蛋白OPA1和Mfn2表达、上调分裂蛋白Drp1和Fis1表达。结论:1.营养饥饿能够增强人卵巢癌细胞SKOV3对BH3模拟物ABT737的凋亡敏感性。2.营养饥饿联合ABT737能够显著抑制卵巢癌细胞的糖酵解功能,卵巢癌细胞因葡萄糖代谢功能不足而死亡。3.营养饥饿联合ABT737可以促进线粒体分裂,而且线粒体分裂可能是凋亡发生之前的上游事件。联用ABT737能够显著增加线粒体损伤,破坏线粒体膜电势,释放促凋亡蛋白最终导致凋亡发生。单纯营养饥饿能够诱导线粒体融合,提示线粒体融合事件可能是SKOV3细胞耐受营养饥饿的原因之一。4.ABT737与营养饥饿联合作用SKOV3细胞后,能够显著干扰Bcl-2家族蛋白的表达,抑制抗凋亡蛋白表达,促进促凋亡蛋白表达,通过活化Bax/Bak诱导线粒体途径的凋亡。基因沉默Bcl-2后能够增强营养饥饿诱导线粒体分裂的能力。提示Bcl-2家族蛋白可能参与调控线粒体分裂融合过程。5.葡萄糖补充有助于恢复ABT737联用营养饥饿导致的糖酵解通量下降,以及线粒体分裂融合平衡的重建,进一步证实线粒体分裂融合平衡可能由葡萄糖代谢与Bcl-2家族蛋白共同调节。综上,糖酵解增强与线粒体融合可能是人卵巢癌细胞SKOV3耐受营养饥饿的原因,联用ABT737通过干扰糖酵解、影响Bcl-2家族与线粒体动力学变化增强凋亡敏感性。通过探讨营养饥饿增加Bcl-2小分子抑制剂敏感性,分析线粒体动力学变化机制,进一步阐明营养饥饿与Bcl-2家族蛋白之间交互调控机制。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.31

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本文编号：1263507