呼吸道合胞病毒复制相关宿主因子的高通量筛选及血小板因子4抗病毒机制研究

发布时间：2017-12-07 22:01

  本文关键词：呼吸道合胞病毒复制相关宿主因子的高通量筛选及血小板因子4抗病毒机制研究

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【摘要】：呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是感染人类的重要呼吸道病毒,主要感染儿童、老人及免疫力低下人群,可导致包括肺炎和支气管炎在内的严重呼吸道疾病,每年在全球造成3380万感染病例和6.6～25.4万死亡病例,是世界范围内导致儿童死亡的主要原因之一。虽然针对RSV的疫苗和治疗性抗体研究取得了一定进展,但目前尚无商品化的疫苗和高效的抗病毒干预手段。研究病毒宿主因子有助于发现新的抗病毒靶点,是当前领域内研究热点和重点。目前对RSV在感染过程中如何影响宿主免疫防御已有一定了解,但对宿主因子在RSV感染中的作用研究较少,尤其缺乏在基因组水平上对RSV复制相关宿主因子的全面认识。为了更全面阐释RSV复制相关宿主因子及其功能,本研究基于含有10001个人类基因cDNA表达文库的高通量筛选,分析影响RSV复制的宿主因子,发现59个宿主因子与RSV的复制相关,通过功能验证,对其中抑制病毒复制功能最强的血小板因子4(Platelet factor 4,PF4)开展了深入的抗病毒功能与机制研究。在RSV宿主限制因子筛选中,本研究将人cDNA表达文库与高通量细胞转染技术相结合,用液体工作站和高内涵显微成像设备,通过免疫荧光分析病毒蛋白表达水平,在RSV感染细胞模型中实现外源基因的过表达和高通量筛选,分析与RSV复制相关的宿主因子。通过实验条件筛选,获得了自动化、高通量和信噪比良好(6.7±0.3)的优化研究体系,完成10001个人类基因cDNA的筛选。以RSV N蛋白荧光信号强度为指标,计算感染率并转换为z score,z score的绝对值反映样本的变异程度,其数值的正负反映变异的方向性。细胞数量z score≥-3的样本为有效数据。以感染率z score=±2作为阈值,z score2的基因为对RSV复制有促进作用,z score-2的为有抑制作用。筛选共获得355个与RSV病毒复制相关的目标基因,其中122个有正调控作用,233个有负调控作用。上述基因经二次验证筛选,确定了细胞色素C氧化酶组装因子1同系物(COA1)、泛素样修饰物激活酶1(UBA1)等10个基因具有正向调控病毒复制的作用,γ-干扰素(IFNG)、血小板因子4(PF4)等49个基因具有负调控作用。利用Western blot和RT-PCR方法对上述筛选后的基因进行功能验证,确定其对RSVN基因的表达具有相应的上调或下调作用。在筛选发现的RSV限制性宿主因子中,PF4具有较高的病毒感染抑制率。PF4是一种分泌型表达的细胞因子,具有调节造血功能、促进凝血与创伤愈合、免疫调节、抗血管新生等多种生理功能,在肿瘤、移植排斥反应和放化疗导致的造血功能障碍治疗中,PF4在动物模型中获得了较好的效果。目前仅有两个研究团队报道了 PF4可抑制流感病毒和HIV复制,对其抗病毒功能的了解还十分有限。为了阐释PF4抑制RSV病毒复制的功能机制,首先我们分析了临床RSV感染婴幼儿外周血PF4浓度,发现与无呼吸道感染人群对照比较,其血浆PF4浓度显著增高(p0.001)。进一步我们在细胞和动物水平对其分析对RSV复制的作用机制。首先,通过在Hela细胞中转染表达PF4蛋白,发现RSVN蛋白随着PF4表达增加而降低,两者存在剂量反应关系,而信号肽缺失的非分泌型PF4突变体对RSV复制无影响;进一步在HEp-2细胞的培养基中加入重组人PF4蛋白后再感染RSV,发现病毒复制受到抑制,且抑制率与PF4浓度呈正相关。上述结果表明分泌型PF4蛋白具有抑制RSV复制的作用。为确定分泌型PF4对病毒复制的抑制作用针对于吸附还是穿入阶段,我们在病毒吸附前、进入阶段和进入结束后分别给予PF4处理,发现只有在吸附前和进入阶段加入PF4蛋白才能下调细胞内RSVN基因表达水平,在病毒吸附前加入PF4的病毒复制抑制作用能够更强,提示PF4主要在RSV吸附阶段发挥作用。PF4可高亲和力结合多种糖胺聚糖,其中包括重要的RSV受体硫酸乙酰肝素(Heparan sμlphate,HS)。因此,我们推测PF4可能通过竞争性结合细胞表面HS而阻断RSV对宿主细胞的吸附。通过将PF4蛋白与不同浓度的肝素混合后孵育HEp-2细胞,弃去混合物后再用RSV感染细胞,发现RSV感染率随肝素浓度上升而增加,表明PF4对RSV感染的阻断依赖于肝素与HS结合能力;免疫荧光共聚焦技术发现HS与PF4和RSV在细胞膜表面分别存在共定位,但PF4与RSV未见共定位,提示PF4结合HS后阻断了 RSV对HS的吸附,限制了病毒的进入。用肠道病毒71(HS为其受体之一)和非HS受体依赖的流感病毒WSN为模型的研究,发现PF4对EV71的复制也具有抑制作用。以上结果表明PF4可通过结合细胞表面受体HS,阻断病毒吸附过程,发挥非特异性的抗病毒作用。在RSV小鼠感染模型中对PF4的抗病毒功能进行验证,发现感染RSV小鼠肺部和血浆PF4水平显著升高(p=0.005);经鼻给予PF4能显著降低小鼠肺部RSV载量,减轻肺部病理损伤,下调气道IL-6炎性因子的水平,表明PF4能通过抑制宿主体内病毒复制减轻RSV的病理损伤。上述结果表明内源性PF4在宿主抗RSV感染中可能具有重要作用。本文通过功能获得性高通量筛选技术,发现了一批RSV感染相关宿主因子,为构建RSV-宿主相互作用网络、阐明RSV感染的调节机制提供了理论基础,也为发现RSV感染相关的生物标志物和新的抗病毒靶点提供了研究方向。对PF4抗病毒机制的研究也首次揭示了其在抗RSV感染中的作用,为深入研究PF4抗病毒功能提供了理论依据。此外,PF4的抗病毒靶点HS在不同类型的细胞中广泛表达,是多种病毒的受体或辅助受体,提示PF4可能具有广谱抗病毒能力,其抗病毒谱和应用潜力还需进一步研究。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R373

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本文编号：1263929