利用免疫分析法解析生—炙甘草对三种经方中主要成分代谢的影响

发布时间：2017-12-08 05:26

  本文关键词：利用免疫分析法解析生—炙甘草对三种经方中主要成分代谢的影响

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【摘要】：甘草来源于豆科植物甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根及根茎,为临床常用中药,其临床应用广泛。在临床应用中有生甘草与炙甘草之分,特别是古代方剂中生甘草与炙甘草的应用区别明显,且不可互相代用。生炙甘草第一次有据可查是源自于《伤寒论》,生炙甘草的不同应用是古人临床实践的结果。本论文利用中药小分子单克隆抗体技术,建立甘草酸、芍药苷、葛根素在小鼠血中含量检测的免疫分析法,研究蜂蜜对甘草中甘草酸代谢的影响,并研究生-炙甘草对芍药甘草汤、四逆散、葛根芩连汤三种经方中主要药味成分配伍的影响,重点从血液和组织层面考察了生-炙甘草与芍药配伍后对芍药苷代谢的不同影响,从代谢的角度利用免疫分析法解析生-炙甘草对三种经方中主要成分代谢的影响,为中药配伍研究提供重要的科学依据。目前国内外对于生-炙甘草的比较研究不少,但尚未有基于免疫分析法的生-炙甘草对经方药味代谢影响差异的比较研究。目的:建立甘草酸、芍药苷、葛根素三种中药小分子成分在小鼠血中含量检测的免疫分析法,同时建立芍药苷在心肝脾肺肾组织中含量检测的免疫分析法,初探蜂蜜对甘草酸在小鼠血中药物代谢动力学特征的影响,进而解析生-炙甘草剂量变化对芍药甘草汤、四逆散及葛根芩连汤中重要药味芍药苷或葛根素的药代动力特征的影响。方法:1.建立基于甘草酸单克隆抗体的甘草酸在小鼠血中的酶联免疫分析法,并进行方法学考察,包括线性、特异性、精密度、准确性、回收率和稳定性等;合成甘草酸单克隆抗体与量子点的结合物,研究量子点对甘草酸酶联免疫分析法的影响,并首次建立基于量子点的甘草酸酶联免疫分析法;2.分别考察蜂蜜对甘草提取物及甘草酸单体,给昆明小鼠灌胃给药后,小鼠血中甘草酸代谢动力学参数的变化,并进一步研究蜂蜜中主要成分(葡萄糖、果糖、蔗糖及三种糖的混合物)对甘草酸代谢的影响:3.建立基于芍药苷单克隆抗体的芍药苷在小鼠血中及组织(心肝脾肺肾)中的酶联免疫分析法,对其进行方法学考察,包括线性、特异性、精密度、准确性、回收率和稳定性等;从药代动力学角度基于血液和组织层面考察生-炙甘草与芍药配伍后对芍药苷药物代谢动力学参数的影响,并从药效学角度借助热板法观察生-炙甘草与芍药配伍后对芍药苷镇痛效果的影响;4.建立基于芍药苷单克隆抗体的芍药苷在小鼠血中的酶联免疫分析法,对其进行方法学考察,包括线性、特异性、精密度、准确性、回收率和稳定性等;解析生-炙甘草分别对四逆散中芍药苷的药代动力特征的影响;5.建立基于葛根素单克隆抗体的葛根素在小鼠血中的酶联免疫分析法,对其进行方法学考察,包括线性、特异性、精密度、准确性、回收率和稳定性等;解析生-炙甘草分别对葛根芩连汤中葛根素的药代动力特征的影响。结果:1.建立了 PBS中甘草酸的酶联免疫分析法,其线性范围为7.81 ng/mL-250 ng/mL,回归方程y=-0.1431n(x)+1.2551(R2=0.9918),精密度及准确性良好,回收率为100.52%-104.02%,适合于甘草提取物中甘草酸的检测,检测稳定性良好;2.建立了基于甘草酸单克隆抗体的甘草酸在小鼠血中的酶联免疫分析法,其线性范围为 7.8 ng/mL-250 ng/mL,回归方程 y =-0.1411n(x)+ 0.9268(R2 = 0.9935),精密度及准确性良好,回收率为98.04%-103.25%;首次建立了基于量子点的甘草酸酶联免疫分析法,量子点稀释倍比1:1000,其线性范围为31 ng/mL-4000ng/mL,回归方程y =-0.074ln(x)+1.0074(R2 = 0.9921),精密度及准确性良好,回收率为101.6%-113.4%,二者均精密度及准确性良好,适合于生物样品的检测,检测稳定性良好;3.单独灌胃给予小鼠甘草提取物后,血中甘草酸血药浓度达峰时间为40min,给予峰蜜与甘草提取物灌胃后,甘草酸血药浓度达峰时间变成240min;单独给予甘草酸单体灌胃小鼠后,血中甘草酸血药浓度达峰时间为45min,给予峰蜜与甘草提取物灌胃后,甘草酸血药浓度达峰时间变成600min;给予葡萄糖与甘草酸单体灌胃小鼠后,血中甘草酸血药浓度达峰时间为45min,给予果糖与甘草提取物灌胃后,甘草酸血药浓度达峰时间变成720min;给予蔗糖与甘草提取物灌胃后,甘草酸血药浓度达峰时间变成45min;给予三种糖的混合物与甘草提取物灌胃后,甘草酸血药浓度达峰时间变成630min;4.建立了基于芍药苷单克隆抗体的芍药苷在小鼠血中及组织中的酶联免疫分析法,其线性范围为3.13 ng/mL-1600 ng/mL,精密度及准确性良好,适合于生物样品的检测,检测稳定性良好。a.生-炙甘草不同剂量组小鼠灌胃给药后,检测血中芍药苷含量,结果显示生甘草高剂量组芍药苷最大血药浓度为14.33ug/mL,达峰时间为35min,炙甘草高剂量组芍药苷最大血药浓度为9.08 ug/mL,达峰时间为35min,生甘草中剂量组芍药苷最大血药浓度为15.37 ug/mL,达峰时间为35min,炙甘草中剂量组芍药苷最大血药浓度为12.42 ug/mL,达峰时间为35min,生甘草低剂量组芍药苷最大血药浓度为11.10ug/mL,达峰时间为35min,炙甘草低剂量组芍药苷最大血药浓度为7.49ug/mL,达峰时间为240min;b.生甘草高剂量组中芍药苷最大血药浓度为0.55ug/mg,炙甘草高剂量组中芍药苷最大血药浓度为0.06ug/mg,具有非常显著性差异,其他剂量下不同组织中生-炙甘草对芍药苷含量的影响显示也有不同差异;c.热板法实验结果显示炙甘草中剂量组小鼠对热板的反应延长时间最长,时间为15.08s,与其对应的生甘草中剂量组小鼠反应延长时间为12.69s,大部分组别中小鼠达到最大反应延长时间的时间点均在60min,而炙甘草低剂量组中为120min;5.四逆散生甘草组中芍药苷最大血药浓度为4949.12ng/mL,达峰时间为35min.炙甘草组中芍药苷最大血药浓度为6732.46 ng/mL,达峰时间为60min;炙甘草组的平均血药浓度时间下曲线面积约为生甘草组的1.5倍;6.建立了基于葛根素单克隆抗体的葛根素在小鼠血中的酶联免疫分析法,其线性范围为 3.9-1000 ng·mL-1,回归方程 y =-0.1661n(x)+1.0016.(R2 = 0.9939)精密度及准确性良好,回收率为104.08%-107.25%;葛根芩连汤生甘草组中葛根素的最大血药浓度为74.38ng/mL,炙甘草组中葛根素最大血药浓度为67.77ng/mL。结论:1.利用酶联免疫分析技术研究蜂蜜对不同配伍的药代动力学特征,蜂蜜与甘草提取物或甘草酸单体联合给药后,小鼠血液中甘草酸的代谢动力学参数均受影响,其中最显著的是对甘草酸血药浓度达峰时间有延长作用,在一定程度上验证了"甘则缓之"中医理论,且这种延长作用很大可能是蜂蜜中的果糖引起的;2.以芍药甘草汤为模板,考察了生-炙甘草与芍药配伍给药后对芍药苷在小鼠血及组织中代谢动力学特征的影响,发现炙甘草相比于生甘草对芍药苷在血中及组织中均有延缓芍药苷达峰时间的效用;在小鼠热板法镇痛实验中,炙甘草较之生甘草与芍药配伍后能显著延长小鼠对热痛的反应时间,推测这种效用是蜜制甘草后对芍药的影响导致的;验证了中药配伍中炙甘草对芍药的配伍效用;3.进一步在多成分复方四逆散及葛根芩连汤中考察生-炙甘草对其他药味的影响,结果显示炙甘草较之生甘草对四逆散中芍药苷有推迟芍药苷达峰时间的作用;炙甘草较之生甘草对葛根芩连汤中葛根素有降低其最大血药浓度的作用,说明了炙甘草在不同中药复方中均具有一定的缓和作用,主要体现在缓和其他药味的药效及其达峰时间上,与中医配伍理论中炙甘草调和诸药相一致。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
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本文编号：1265209