人参皂苷Rb1促进局灶性脑梗死小鼠轴突再生及其机制研究
发布时间：2017-12-08 05:31
本文关键词：人参皂苷Rb1促进局灶性脑梗死小鼠轴突再生及其机制研究
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【摘要】：脑卒中是当前严重威胁人类健康的疾病之一,据最新统计,在我国脑卒中致死率已位居所有病因的首位。同时,目前中国脑血管病发病率亦居世界首位,高于美国近1倍。其中缺血性脑卒中占总数的80%~85%。世界卫生组织调查结果显示,缺血性脑卒中具有高发病率、高致死率、高致残率和高复发率等特点,在幸存的脑卒中患者中,尤其是致残的患者,其健康和生存质量受到严重影响,并给家庭和社会带来了沉重的负担。研究发现缺血性脑卒中后常表现出神经功能一定程度的恢复,提示脑组织具有一定程度的自我修复能力。这种自我修复能力与神经可塑性密切相关,而轴突再生则是神经重塑的重要过程。之前通过对动物模型的研究发现,脑梗死后给予适当的药物或运动锻炼等干预措施,可以刺激脑组织内源性轴突再生,有利于神经网络的重新连接,以代偿一部分失神经支配区域的神经功能。因此,寻找适合、有效的药物以促进缺血性脑卒中患者的康复和预后,提高生存质量,一直是医学研究的热点和方向。近年来,祖国传统中草药对于卒中治疗的积极作用已越来越受到国内外的重视,其具有效果明显、副作用小、多靶点、多方向和多途径等众多优点,所以我们致力于从中草药中筛选出有利于卒中恢复的药物。人参是我国的传统中药,被用于多种疾病的治疗和预防。人参皂苷Rb1(GRb1)是人参的主要活性成分,早已被证实可在脑缺血急性期通过抗氧化和抗炎等机制发挥神经保护的作用。它可通过PKA信号通路促进神经递质的释放,还被发现可在体外实验中促进周围神经施万细胞的增殖等。这些作用都与脑梗死后神经功能的恢复密切相关。然而人参皂苷Rb1在脑梗死后慢性期的作用以及是否可以促进中枢神经的轴突再生尚没有明确的文献支持。本研究选用雄性C57BL/6小鼠为研究对象,电凝法建立小鼠局灶性大脑中动脉皮层梗死(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)模型,观察脑缺血后应用GRb1治疗后运动功能的恢复情况、轴突再生的形态学变化及生长相关蛋白-43(GAP43)的表达、cAMP和PKA的水平以及pkac与p-creb的蛋白表达,以探讨grb1是否可以促进运动功能恢复和轴突再生以及其发挥作用的潜在机制。同时,我们引入pka抑制剂h89作为对比观察,以进一步确认grb1与pka通路的关系。造模后3天、7天、14天和28天作为实验观察时间点。本研究分三部分,现将各部分内容分别概述如下。第一部分人参皂苷rb1对局灶性脑梗死小鼠运动功能恢复的作用目的:通过观察局灶性脑梗死小鼠运动功能恢复的情况,研究grb1在脑梗死后慢性期对运动功能的恢复是否具有促进作用以及起效时间。方法:选用成年雄性c57bl/6小鼠为研究对象,采用电凝法制备大脑中动脉皮层梗死模型。随机将c57bl/6小鼠分为5组:假手术组(sham)、梗死组(mcao)、grb1治疗组(grb1)(mcao+grb1,50mg/kg)、h89干预组(m+h)(mcao+h89,2μl,i.c.v.)、grb1和h89干预组干预组(m+h+g)(mcao1+h89++grb1)。sham组:假手术后24h腹腔注射等量生理盐水。mcao组:术后24h腹腔注射等量生理盐水。grb1组:术后24h腹腔注射grb1溶液50mg/kg。m+h组:术前给予脑室注射h89溶液2μl,术后24h腹腔注射等量生理盐水。m+h+g组:术前给予脑室注射h89溶液2μl,术后24h腹腔注射grb1溶液50mg/kg。给药或溶剂次数为每日一次,持续至术后14天。于术后3天、7天、14天和28天进行rotarod实验和平衡木脚步失误实验。结果:1rotarod实验:sham组几乎没有运动功能缺损表现,平均跑轮时间大于300s,而其它各组平均跑轮时间均低于300s。与mcao组相比,grb1组跑轮时间在术后14天和28天更长,差异有统计学意义(p0.05);m+h组与m+h+g组在术后7天、14天、28天均低于mcao组(p0.05),并且这两组之间没有明显的差异(p0.05);2平衡木脚步失误实验:sham组在行走中几乎没有脚步失误,而其它各组均出现不同程度的脚步失误。grb组脚误次数在术后7天、14天和28天少于mcao组,差异有统计学意义(p0.05);而m+h组与m+h+g组在术后7天、14天和28天的脚误次数均多于mcao组(p0.05),并且这两组之间没有明显的差异(p0.05)。第二部分人参皂苷rb1对局灶性脑梗死小鼠轴突再生的影响目的:观察脑缺血梗死后皮层内轴突再生的变化,研究grb1在脑梗死后慢性期是否具有促进轴突再生的作用。方法:以成年雄性c57bl/6小鼠为研究对象,采用电凝法制备大脑中动脉皮层梗死模型。随机将c57bl/6小鼠分为2组:a组和b组,每组又分为5个亚组:假手术组(sham)、梗死组(mcao)、grb1治疗组(grb1)(mcao+grb1,50mg/kg)、h89干预组(m+h)(mcao+h89,2μl,i.c.v.)、grb1和h89干预组(m+h+g)(mcao1+h89++grb1)。sham组:假手术后24h腹腔注射等量生理盐水;mcao组:术后24h腹腔注射等量生理盐水;grb1组:术后24h腹腔注射grb1溶液50mg/kg;m+h组:术前给予脑室注射h89溶液2μl,术后24h腹腔注射等量生理盐水;m+h+g组:术前给予脑室注射h89溶液2μl,术后24h腹腔注射grb1溶液50mg/kg。给药或溶剂次数为每日一次,持续至术后14天。术后14天对b组小鼠健侧感觉运动皮层注射生物素葡聚糖安(bda,2μl)。a组分别于术后3天、7天、14天和28天取材并应用免疫荧光法观察梗死周围皮层内gap43的表达;应用westernblot和qrt-pcr的方法检测梗死周围皮层内gap43蛋白水平和mrna水平。b组于术后28天取材,应用免疫组化法和免疫荧光观察双侧皮层内被bda标记的神经元或轴突,应用免疫荧光双染观察梗死周围皮质内bda与gap43共定位情况。结果:1a组梗死周围皮层gap43荧光表达:与mcao组相比,grb1组在术后7天、14天和28天增多,同时m+h组与m+h+g组表达减少,差异有统计学意义(p0.05),m+h+g组表达在术后7天和14天多于m+h组(p0.05);sham组始终低表达,且低于mcao组(p0.05);2a组梗死周围皮层gap43蛋白和mrna表达趋势基本一致:与mcao组相比,grb1组在术后7天、14天和28天升高;m+h组与m+h+g组在术后7天、14天表达降低,差异有统计学意义(p0.05),m+h+g组表达在术后7天和14天多于m+h组(p0.05);sham组始终低于mcao组;3b组免疫组化染色观察可发现各缺血组的健侧和缺血侧皮层有一定量bda标记的神经元或轴突纤维,sham组只有极少数bda标记的神经元和轴突;4b组通过免疫荧光染色统计发现grb1组小鼠健侧皮层内被标记的神经元和轴突的数目略高于其它组(p0.05),除sham组较少外,其余各组无显著差异(p0.05);缺血侧皮层内被标记轴突纤维的数目:与mcao组相比,grb1组较多,而m+h组与m+h+g组较少,差异有统计学意义(p0.05),m+h+g组略多于m+h组(p0.05);sham组数量较低;5b组观察梗死周围皮质内bda与gap43共定位区域发现,mcao组共染的阳性面积少于grb1组,但多于m+h组与m+h+g组,差异有统计学意义(p0.05),m+h+g组与m+h组并无显著差异(p0.05);sham组共染阳性面积也低于mcao组。第三部分人参皂苷rb1促进局灶性脑梗死小鼠脑内轴突再生与pka信号通路的联系目的:观察局灶性梗死小鼠脑组织内pka信号通路相关分子的变化,研究grb1促进梗死后轴突再生的机制是否与pka信号通路有关。方法:选用成年雄性c57bl/6小鼠为研究对象,采用电凝法制备大脑中动脉皮层梗死模型。随机将c57bl/6小鼠分为5组:假手术组(sham)、梗死组(mcao)、grb1治疗组(grb1)(mcao+grb1,50mg/kg)、h89干预组(m+h)(mcao+h89,2μl,i.c.v.)、grb1和h89干预组(m+h+g)(mcao1+h89++grb1)。sham组:假手术后24h腹腔注射等量生理盐水。mcao组:术后24h腹腔注射等量生理盐水。grb1组:术后24h腹腔注射grb1溶液50mg/kg。m+h组:术前给予脑室注射h89溶液2μl,术后24h腹腔注射等量生理盐水。m+h+g组:术前给予脑室注射h89溶液2μl,术后24h腹腔注射grb1溶液50mg/kg。给药或溶剂次数为每日一次,持续至术后14天。分别于术后3天、7天、14天和28天取材,应用酶联免疫吸附实验(elisa)检测双侧大脑皮层内camp和pka的水平,应用westernblot法检测双侧大脑皮层内pkac和p-creb蛋白水平。结果:1大脑皮层内的cAMP水平:各缺血组在术后3天低于sham组;与MCAO组相比,sham组与M+H组在术后7天和14天水平较低,GRb1组和M+H+G组在术后7天、14天和28天较高(P0.05);与M+H+G组相比,GRb1组在术后14天较高,M+H组在术后7天、14天和28天较低(P0.05);2大脑皮层内的PKA水平:各缺血组在术后3天低于sham组;与MCAO组相比,sham组、M+H+G组和M+H组在术后7天14天的水平较低,GRb1组则在术后7天、14天和28天较高(P0.05);与M+H组相比,M+H+G组在术后7天和14天较高(P0.05);3通过western bolt检测发现,脑皮层内的PKAc与p-CREB的蛋白表达趋势基本一致:与MCAO组相比,GRb1组在术后7天、14天和28天表达上调,M+H+G组和M+H组在术后7天、14天和28天表达下调,M+H+G组的蛋白表达在术后7天和14天高于M+H组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:1人参皂苷Rb1可促进局灶性脑梗死小鼠在梗死后慢性期的运动功能恢复。2人参皂苷Rb1可促进局灶性脑梗死小鼠在梗死后慢性期的轴突再生能力。3人参皂苷Rb1促进局灶性脑梗死小鼠在梗死后慢性期的轴突再生的作用可能是通过提升脑组织内cAMP的含量,继而激活cAMP/PKA/CREB信号通路实现的。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.33
【参考文献】
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1 沈雪;玄灄慧;秦i，
本文编号：1265236
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