蝙蝠蛾拟青霉液体发酵菌丝体多糖对实验性糖尿病保护作用探讨

发布时间：2017-12-08 07:34

  本文关键词：蝙蝠蛾拟青霉液体发酵菌丝体多糖对实验性糖尿病保护作用探讨

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【摘要】：蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces Hepiali)是天然冬虫夏草中分离获得的内寄生菌,药理活性显著,早在2001年卫生部发布的《可用于保健食品的真菌菌种名单》中,蝙蝠蛾拟青霉就已被批准为保健食品真菌。大量研究表明,蝙蝠蛾拟青霉菌丝体具有与冬虫夏草相似的活性组成及药理药效。本研究采用化学诱变的方法对蝙蝠蛾拟青霉菌株进行诱变筛选,并探究诱变菌株菌丝体胞内多糖对实验性糖尿病保护作用,为蝙蝠蛾拟青霉作为新型抗糖尿病药物的开发提供理论依据。提升大型真菌发酵水平的两个非常有效的途径是改良菌株遗传特性和改善菌株发酵工艺过程。在本研究中,采用亚硝基胍对蝙蝠蛾拟青霉菌株进行诱变选育,以菌丝体干重为考察指标,通过高通量筛选技术筛选获得蝙蝠蛾拟青霉高产菌株PH40。该菌株可稳定遗传十代以上,具有良好的遗传稳定性。检测该菌株生长曲线可知,蝙蝠蛾拟青霉PH40最佳摇瓶培养时间为96 h;采用化学计量学方法,优化获得蝙蝠蛾拟青霉PH40最佳摇瓶培养基配方为:葡萄糖21.9 g/L,酵母浸粉15.74 g/L,蛋白胨10 g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L,硫酸镁0.5 g/L,氯化钠0.5 g/L,氯化锌0.011 g/L,维生素B1 0.1 g/L。在此条件下,蝙蝠蛾拟青霉最大摇瓶菌丝体产量达25.24 g/L,是未优化的1.4倍。采用高糖高脂饲料喂养与小剂量STZ注射联合诱导的方法建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型,建模成功大鼠连续4周灌胃蝙蝠蛾拟青霉菌丝体水提物(PHC)或盐酸二甲双胍(Met)进行治疗,考察PHC对大鼠糖尿病及肾病并发症的保护作用。结果显示,与模型组相比,PHC显著缓解糖尿病引起的大鼠体重下降,降低大鼠空腹血糖值及糖化血红蛋白水平,同时,给药组大鼠血浆总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平均显著降低,证明PHC具有显著的降血糖及降血脂活性。PHC有效提高大鼠血浆胰岛素及丙酮酸激酶含量,促进糖原合成,加速血浆葡萄糖代谢。同时,PHC显著抑制糖尿病大鼠血浆及肾脏组织中白介素-2、白介素-6、白介素-10、肿瘤坏死因子-α分泌,增加血浆白蛋白水平,证明其对大鼠糖尿病肾病具有很好的缓解和治疗作用。与模型组相比,PHC有效降低大鼠肾脏组织核转录因子-κB(NF-κB)水平,推测其可能通过NF-κB相关信号通路实现对糖尿病大鼠肾脏组织的保护作用。多糖是真菌菌丝体内重要的组成成分,具有显著的药理活性。在本研究中,以多糖提取率为响应值,采用化学计量学方法优化获得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体胞内多糖最佳水提工艺为:提取温度79.18℃,提取时间3.94 h,液料比46.56:1,通过回归方程预测得到最优的多糖提取率为13.08%。较为优化前,多糖提取率显著上升。采用乙醇醇沉、DEAE-52离子交换层析、Superdex G200凝胶柱层析等方法对蝙蝠蛾拟青霉菌丝体水提液进行分离纯化,筛选获得纯化多糖(PHEA)。高效液相色谱检测结果显示,PHEA为均一单峰,具有良好的均一性,其平均分子量为3011.47 k Da;单糖组成分析结果显示,PHEA主要单糖组成为D-阿拉伯糖、D-甘露糖及D-葡萄糖,其分子组成比为2.65:1:1.04;紫外光谱扫描结果显示,PHEA在260 nm及280 nm波长情况下均无特征吸收峰,证明其组分中不含有核酸及蛋白质,组成单一;红外光谱扫描结果显示,PHEA中存在明显的-OH、C-H、C=O特征吸收峰,及C-O-C、C-O-H、吡喃环等骨架链接;高碘酸氧化及Smith降解实验显示,PHEA中可能包含(1→2)-糖苷键、(1→4)-糖苷键及(1→6)-糖苷键连接。为了进一步考察蝙蝠蛾拟青霉菌丝体纯化多糖PHEA抗糖尿病及肾病并发症活性,采用db/db小鼠模型,连续8周灌胃给予PHEA或盐酸二甲双胍,给药期间,每周检测小鼠空腹血糖及体重变化。结果显示,与模型组相比,PHEA有效降低db/db小鼠体重增长速度、空腹血糖值及糖化血红蛋白水平,提高小鼠血浆葡萄糖代谢速度,降低摄食后血糖峰值,缓解由高血糖引起的小鼠饮食、饮水增加状况,对小鼠糖尿病症状具有很好的改善作用。生化指标检测结果证实,PHEA显著提高小鼠血浆胰岛素、丙酮酸激酶水平,促进血浆葡萄糖吸收和代谢,抑制糖原合成酶激酶(GSK-3)活性,增加机体糖原合成,抑制糖原分解,降低小鼠血浆甘油三酯、总胆固醇水平,提高高密度脂蛋白胆固醇含量,改善小鼠脂代谢紊乱,具有显著的降血糖及降血脂活性。PHEA显著提高小鼠血浆及肾脏组织中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶活性,降低丙二醛及肾脏组织中活性氧簇含量,降低机体氧化应激。同时,PHEA有效降低小鼠肾脏组织细胞间黏附分子-1、卷曲蛋白-6、单核细胞趋化蛋白-5、白介素-1β、粒细胞集落刺激因子等炎症因子水平,抑制肾脏组织中AKT、GSK-3β、NF-κB、信号传导与转录激活因子等蛋白的活性表达,提高CAT、血红素氧合酶1、核因子相关因子2等蛋白表达水平,缓解高血糖引起的组织氧化应激及炎症因子损伤,实现其对实验性糖尿病小鼠肾脏组织的保护作用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R965

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本文编号：1265582