中药复方益肺通络颗粒有效成分的质量与活性研究

发布时间：2017-12-09 05:26

本文关键词：中药复方益肺通络颗粒有效成分的质量与活性研究

【摘要】：结核病是全球流行性传染病中致人死亡的主要疾病。尤其是近些年来环境污染所致的免疫低下、HIV和乙肝感染、抗结核药物的毒副作用、多药耐药、广泛多药耐药等多方面因素,使结核病的发病率重新出现上升的趋势。最新结核病发病机制的深入研究发现结核病在发生、发展的过程中都与宿主的免疫调节能力紧密相关,其中有大量细胞因子参与了免疫调节,细胞因子的含量变化与疾病的病损程度以及病理变化有着密切的关系,多种因子的变化可以作为疾病诊断的标准,通过有针对性的对这些细胞因子进行干预,为预防和治疗结核病开辟新的途径,因此中药结核免疫治疗也越来越显现其特殊的优越性。益肺通络颗粒由国家"十一五"和"十二五"传染病防治国家重大科技专项支持,中期临床疗效显著,但其体内作用的物质基础和作用机制不明确。本课题选择了抗结核临床疗效确切的益肺通络颗粒作为研究对象,综合运用各种国际前沿免疫治疗理论及先进的技术手段,对该药品的体内作用机制、物质基础以及质量控制开展了初步研究。本课题主要研究内容包括:(1)通过所建立的小鼠免疫低下模型,评价了益肺通络颗粒的总提取物和多糖组分的体内药理活性和免疫调节作用机制;(2)从多波长指纹图谱、主要活性化学成分的定性定量等方面阐明了益肺通络颗粒的药效物质基础;(3)对其药效物质基础的体内动态变化过程进行了研究,为益肺通络颗粒的临床药物监测和用药安全提供科学依据;(4)对君药白芨中主要活性成分以及抗炎作用机制进行了研究,阐述了白芨抗炎物质基础和作用机理。益肺通络颗粒的药理作用机制研究包括药物提取组分体外药敏实验、体内免疫低下模型的建立、药物提取物小分子组分和多糖组分体内免疫调节作用机制的评价。首先通过体外药敏试验来筛选益肺通络复方中抗结核活性比较显著的提取部位,检测结果显示所有提取物在可能达到的浓度范围内均没有显现出体外抗结核分枝杆菌的效果。然后我们根据结核病与免疫的关系以及益肺通络复方和单方的药理活性以及临床相关报道,将研究重点转移到益肺通络颗粒在体内外的免疫治疗作用研究。为了明确复方中各组分的免疫调节作用,我们将复方提取物分为小分子组分和多糖组分并分别对它们在体内外免疫以及抗氧化活性进行了研究。实验结果表明,在体外两部分均具有较好的自由基清除能力且巨噬细胞也均具有明显的保护作用,对与巨噬细胞相关的免疫功能和炎症反应也可能有一定程度的干预和调节的作用。在体内也首次证明了复方具有免疫调节以及抗氧化的功效,表明益肺通络颗粒是通过免疫调节来提升机体内的免疫防御能力。药理作用机制研究的结果为益肺通络颗粒通过免疫调节辅助治疗耐药结核病提供了有力的依据,也为进一步提高该药品的抗结核治疗效果和大面积临床应用奠定了药理基础。益肺通络颗粒的小分子有效成分物质基础研究包括指纹图谱的建立、主要有效成分的结构鉴定和定量分析。采用HPLC-DAD技术建立了益肺通络颗粒的双波长指纹图谱(272和300 nm),对各特征峰进行了单方归属,并采用"中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)"软件对其进行评价,为复方制剂成分分析奠定了基础。结合LC-HRMS技术共鉴别出了益肺通络颗粒中19种化学成分,其中香豆素类、酚酚类、黄酮类、生物碱类以及苹果酸酯类成分相对含量较高,主要来源于君药白芨、百部、臣药矮地茶、紫花地丁、大蓟、佐药天冬等。并以LC-MS/MS方法确定了复方中新绿原酸、岩白菜素、隐绿原酸、绿原酸、秦皮乙素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、Militarine、蒙花苷、大蓟苷的含量分别为:0.121 ±0.018、0.318±0.039、0.096±0.019、0.100±0.018、0.207 ±0.031、0.085 ± 0.021、0.058 ±0.014、0.103 ±0.020、2.152 ±0.195、0.091±0.014、0.183±0.028 mg/g,为阐明该方药效物质基础及质量控制提供了依据。益肺通络颗粒的体内物质基础研究对益肺通络颗粒的主要成分体内药物动力学行为的探讨。实验结果发现岩白菜素、秦皮乙素、芦丁三种成分在大鼠体内的半衰期T1/2比以往报道约增加了一倍。复方制剂益肺通络颗粒的药代特性进一步揭示了中药复方体系药代研究的复杂性,为益肺通络颗粒的临床药物监测和用药安全提供科学依据。益肺通络颗粒的君药评价重点放在前期研究较少的白芨的有效成分、抗氧化抗炎药理作用机制的研究。三味君药中,有关黄精和百部相关的研究比较多,药效成分和药理活性比较明确,而对白芨的活性方面的研究仍旧停留在对白芨多糖的研究上,再结合本研究所揭示的、复方中含量最高的成分Militarine成分来自于白芨中。在预实验研究中发现,白芨脂溶性成分在抗氧化抗炎效果上要明显优于白芨多糖,所以我们认为可能是脂溶性成分在其中发挥了主要作用。首先对白芨中的脂溶性成分的各分组组分的总酚含量进行了测定,各组分清除自由基能力与多酚含量成正比。继而通过在LPS诱导的肺泡巨噬细胞NR8383和体内急性(ALI)炎症反应模型,评价了抗氧化活性最高的组分BM60抗炎功效。结果表明经BM60给药治疗后大鼠肺泡结构有明显的恢复,间隔水肿减轻,肺泡腔中炎性细胞的渗出减少。同时BM60还能够一定程度地抑制ALI肺组织中NF-kB和TNF-α、IL-1β、IL-6相关炎性因子的表达,进而减轻ALI大鼠肺部的炎症反应。。接下来采用HPLC-ESI-HRMS技术通过比较其化学式和不饱和度以及商业标准品和文献资料来对BM60进行定性分析。最终鉴别出BM60中23种化合物,联苄类化合物6个,菲类化合物8个,二氢菲类化合物4个,联菲类类化合物1个,黄酮类类化合物1个和2-异丁基苹果酸葡糖基氧基苄基酯3个,其中联苄、菲类化合物种类较多,相对含量较高。该方法表征了白芨BM60部分的主要成分并为新的抗氧化抗炎活性成分的开发提供了研究基础。综上所述,本课题研究基本上明确了益肺通络颗粒的免疫作用机制和药效物质基础,通过指纹图谱和有效成分定量技术的建立对该产品的质量控制进行了合理的完善和丰富,体内物质基础研究从药代动力学的角度初步探讨了其在体内吸收、代谢的规律,并对前期研究较少的君药白芨的抗氧化抗炎机制和物质基础进行了初步研究。本课题对益肺通络颗粒的作用机制和物质基础研究为进一步提高该药品的抗结核疗效和更大范围的临床应用提供了理论和实验依据。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R286.0;R285

【参考文献】

中国期刊全文数据库前10条

1 徐凤华;黄明;张全英;;LC-MS/MS测定人血浆中普瑞巴林浓度及其药动学研究[J];中国药学杂志;2017年03期

2 支旭然;刘洪涛;吴茵;白万军;董占军;;UPLC-MS/MS法同时测定肾康注射液中7个有效成分[J];药物分析杂志;2017年01期

3 周里欣;林彦朝;章运典;陈洪英;;黄芩配方颗粒的高效液相色谱指纹图谱研究[J];中国药业;2017年02期

4 李元元;;延胡索HPLC指纹图谱研究[J];西北药学杂志;2017年01期

5 高皓诗;魏悦;佟立今;张天虹;;大鼠血浆中岩白菜素含量分析方法的建立及其体内药动学[J];沈阳药科大学学报;2016年12期

6 钟金凤;方热军;;环磷酰胺免疫抑制机制及在动物模型上的应用[J];中国免疫学杂志;2016年10期

7 于桂芳;闫显光;殷洪梅;李家春;黄文哲;王振中;萧伟;;益心舒片的HPLC指纹图谱[J];中国实验方剂学杂志;2017年01期

8 任金凤;赵跃;王菊仙;;抗结核药物研究新进展[J];中国医药生物技术;2016年04期

9 杨建华;迪丽拜尔·马木提;王梅;王晓梅;胡君萍;;秦皮甲素和秦皮乙素在大鼠体内的药物动力学研究[J];中药新药与临床药理;2016年04期

10 康静;季飞飞;杨波;谢春锋;许婧;郭远强;;款冬花的化学成分研究[J];药学研究;2016年07期