DNA甲基化模式异常在PM2.5致肺癌过程中的作用
本文关键词：DNA甲基化模式异常在PM2.5致肺癌过程中的作用
更多相关文章： PM2.5 暴露情境 DNA甲基化 ROS-Akt-DNMT3B 肺癌
【摘要】：背景和目的:近年来,全国范围内空气细颗粒物(Fine Particulate Mater,PM2.5)污染已严重影响到人们的生产生活,由PM2.5污染所导致的各种公众健康问题已受到政府和人民越来越多的关注。流行病学研究已表明,PM2.5长期暴露可导致人群中肺癌发病风险和因肺癌死亡率不断攀升。仅2015年,在我国因PM2.5污染导致的肺癌死亡人数就占全国肺癌总死亡人数的23.9%。2013年,国际癌症研究机构(IARC)正式将PM2.5列为人类I类致癌物。目前,PM2.5引起肺癌的机制尚未完全清楚。阐明PM2.5的致癌机制将为制定有效的干预措施和进行PM2.5的风险评价与管理提供重要依据。随着表观遗传学研究的不断深入,大量研究发现在肿瘤发生发展过程中常涉及全基因组和/或特定基因的DNA甲基化状态异常。人群流行病学资料亦证实PM2.5持续暴露可导致机体DNA甲基化模式改变。提示PM2.5诱导DNA甲基化模式异常可能是PM2.5致肺癌发生发展过程中的一个重要环节,但其急需机制研究加以证实与补充,同时PM2.5是如何诱导DNA甲基化模式异常仍需进一步研究。由于伦理学限制,现有研究多采用体外动物实验或细胞实验探索PM2.5引发肺癌的相关机制。然而,大多数体外研究在暴露剂量、暴露时间等实验条件的选择上很少基于现实暴露情境,简单地认为PM2.5毒性效应是“量”的累积,常在高浓度急性暴露情境下探讨PM2.5致癌的可能毒性机制,不利于问题的解释和研究结论的外推。因此,基于真实暴露情境进行的机制研究,可真实和全面地反映PM2.5暴露过程中DNA甲基化变化及其在PM2.5致肺癌过程中的作用,有助于揭示PM2.5真实的致病机制。基于上述考虑,本研究利用BEAS-2B细胞,首次通过体外构建两种暴露模型,分别模拟现实生活中高浓度急性暴露和低浓度长期暴露两种常见的暴露情境,系统性对比分析不同暴露情境下PM2.5毒性效应的差异及相关毒性机制。然后选用合适的暴露模型,分析PM2.5持续暴露过程中细胞全基因组甲基化状态和P53基因DNA甲基化水平,探索PM2.5暴露引起DNA甲基化模式异常的相关分子机制,揭示DNA甲基化模式异常在PM2.5致肺癌过程中的作用,旨在为阐明PM2.5致肺癌的表观遗传学机制奠定基础,同时亦为今后开展PM2.5致癌风险评估、修订我国空气质量标准和制定有效的干预措施提供重要实验依据。方法:首先,利用粒度仪、稳定分析仪和透射电子显微镜(TEM)对采集到的PM2.5进行粒径、稳定性和形貌进行分析。然后,通过多路径颗粒沉积模型(MPPD模型)基于现实暴露情境设计高剂量急性暴露(6μg/cm2,12μg/cm2,24μg/cm2,48μg/cm2,96μg/cm2,单次染毒BEAS-2B细胞24h)和低剂量重复暴露(1.5μg/cm2,3μg/cm2,6μg/cm2;重复暴露10d)两种暴露模型。在两种暴露模型中,分别采用CCK-8和LDH漏出率分析PM2.5染毒后的细胞毒性,通过TEM观察PM2.5对细胞超微结构的影响,利用CM-H2DCFDA荧光探针分析细胞内ROS水平,采用彗星实验检测PM2.5对DNA的损伤情况,利用流式细胞术分析细胞周期分布以及细胞凋亡和坏死发生率,采用Western Blot检测PM2.5对细胞DNA损伤修复、自噬、线粒体功能、炎性因子和表观遗传调控等相关蛋白表达的影响,采用化学发光法检测细胞内ATP水平,利用q RT-PCR分析PM2.5暴露后细胞内质网应激和UPR状态、P53 m RNA表达情况,采用比色法检测细胞内全基因组DNA甲基化水平变化,利用BSP分析P53启动子区域DNA甲基化状态,以及采用EMSA分析P53启动子区域DNA与核蛋白结合情况。此外,还通过si RNA干扰、ROS清除、抑制剂等方法进行高剂量急性暴露模型中细胞坏死原因的探讨和分析低剂量暴露模型中细胞内ROS-Akt-DNMT3B信号通路的作用。结果:1.本研究所采用的PM2.5的平均粒径为0.74±0.08μm,在培养基中具有良好的分散性,较少发生聚集沉淀。TEM显示PM2.5组成复杂、形态各异。2.在高剂量急性暴露模型中,高浓度PM2.5(≥24μg/cm2)能明显抑制细胞活力,增加细胞内LDH漏出,诱导细胞内ROS生成急剧增多,造成线粒体肿胀甚至空泡化、内质网扩张等改变,导致细胞DNA严重损伤。同时,随着暴露浓度的增加,PM2.5能磷酸化激活细胞内P53和H2A.X,上调P21、PARP-1表达,但并未引起细胞周期阻滞、细胞凋亡和胞内cleaved Caspase-3明显变化,反而促进细胞坏死的发生率和细胞内的IL-6水平升高。高浓度PM2.5暴露还能剂量依赖性激活m TOR-Beclin1-LC3B信号通路,诱导细胞自噬发生,上调细胞内P62/SQSTM1蛋白水平。进一步分析细胞内线粒体功能和ER-Stress相关分子变化,发现PM2.5虽能激活PGC-1α通路促进线粒体新生和功能,但细胞内ATP水平却随着PM2.5浓度的增加而显著降低,高浓度组(≥24μg/cm2)甚至不到对照组的30%。PM2.5能上调GRP78表达,但不能激活下游的UPR反应。在表观遗传调控方面,高浓度PM2.5短时间暴露可诱导细胞内DNMT1、SIRT1表达增加,抑制细胞内DNMT3B蛋白含量,而对DNMT3A表达无影响3.高浓度PM2.5急性暴露还能剂量依赖性增加细胞内HO-1水平,并促使其富集于线粒体,抑制细胞色素C释放。自噬抑制剂3-MA预处理和HO-1表达沉默后,能相互独立地降低高浓度PM2.5导致的细胞坏死,促进细胞凋亡发生。4.在低剂量重复暴露模型中,≤6μg/cm2的PM2.5重复暴露10d后,不产生明显的细胞毒性,但可诱导细胞内ROS低水平上升,导致部分线粒体轻微肿胀,仅在高剂量组(6μg/cm2)出现明显的DNA损伤。同时,随着PM2.5浓度增加,细胞内除H2A.X磷酸化激活外,cleaved PARP-1增加显著,P53和P21反而剂量依赖性降低。低剂量PM2.5重复暴露可导致细胞发生S期阻滞,促进细胞内cleaved Caspase-3表达增加,诱导细胞凋亡发生和细胞内IL-6低水平增加。PM2.5重复暴露虽未引起m TOR-Beclin1-LC3B信号通路激活和P62/SQSTM1蛋白表达,但细胞内却出现降解性自噬小体和层状小体。低剂量PM2.5重复暴露还能激活ER-Stress和下游的UPR反应,抑制NRF-1蛋白表达,诱导细胞内ATP降低。另外,PM2.5重复暴露可抑制细胞内DNMT1表达,增加DNMT3B细胞内含量,对SIRT1和DNMT3A无影响。5.低剂量PM2.5重复暴露可诱导细胞内ROS持续低水平增加。重复暴露5d后,PM2.5虽未引起明显DNA损伤、细胞周期阻滞和细胞凋亡发生,却能显著减少细胞内DNMT1蛋白表达,造成细胞全基因组甲基化水平降低,同时剂量依赖性上调细胞内DNMT3B蛋白含量和磷酸化Akt水平。重复暴露10d后,随着暴露浓度的增加,PM2.5可导致P53基因启动子区域甲基化胞嘧啶位点逐渐增多,并显著降低细胞内P53 m RNA水平和P53蛋白含量。EMSA结果显示PM2.5诱导的甲基化胞嘧啶碱基可显著抑制核蛋白与DNA结合。通过ROS清除剂(NAC)和Akt抑制剂(LY294002)预处理后发现,NAC和LY294002能显著降低细胞内的Akt磷酸化激活和DNMT3B蛋白表达水平,抑制由PM2.5暴露导致的P53基因启动子甲基化水平增加,最终恢复细胞内P53蛋白表达。结论:1.在两种不同的暴露情境下,PM2.5暴露在的细胞活力、胞内氧化水平、遗传物质损伤、细胞应激修复反应、能量供应、炎性水平、表观遗传调控以及细胞结局等方面产生的毒性效应差异明显。研究结果表明高浓度PM2.5急性暴露,常诱发细胞严重损伤,超出细胞自身应激修复能力,导致细胞稳态破坏,致使细胞出现不可控的“崩塌效应”,最终引起机体出现急性炎性症状发作等结局;而低剂量PM2.5长时间暴露,虽无明显细胞毒性,但反复低氧化、低炎性刺激可促使机体内细胞处于病理性适应状态,触发许多跟低水平氧化应激相关的疾病发生等。因此,本研究结果提示“暴露情境”可能是决定PM2.5毒性效应及相应的致病机制的重要影响因素之一。2.高浓度PM2.5急性暴露,可通过诱发BEAS-2B细胞内HO-1过度表达及线粒体富集,阻止线粒体内细胞色素C的释放,从而抑制细胞凋亡。同时,高浓度的PM2.5在短时间内上调细胞内自噬活动,造成自噬流紊乱,触发细胞自噬相关性坏死。因此,该暴露过程中PM2.5诱导产生的HO-1实则“助攻”细胞坏死的发生,发挥其负面效应。3.低剂量PM2.5重复暴露导致细胞内ROS持续低水平增加,可能通过抑制细胞内DNMT1蛋白表达造成细胞全基因组低甲基化。同时,PM2.5暴露还能通过激活细胞内ROS-Akt-DNMT3B信号通路,诱导P53基因启动子甲基化水平升高,进而导致P53基因转录表达水平降低,引起细胞内P53蛋白水平降低。PM2.5诱导的全基因组低甲基化和P53启动子高甲基化可能诱发并促进肺癌的发生。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2;R994.6
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 尚世强,俞锡林,洪文澜,俞惠民,孙眉月;DETECTION OF BACTERIAL DNA BY PCR AND REVERSE HYBRIDIZATION IN THE 16s rRNA GENE[J];Journal of Zhejiang University Science;2000年02期
2 MA Wen li;DNA Diagnosis and Gene Therapy:Advances and Prospects in the 21st Century[J];深圳大学学报;2000年04期
3 葛学铭,陆应麟,付生法,范文红,刘爽;A NOVEL HUMAN DNA SEQUENCE WITH TUMOR METASTASIS SUPPRESSIVE ACTIVITY[J];Chinese Journal of Cancer Research;2000年02期
4 曹晖,刘玉萍,小松かつ子,毕培曦,邵鹏柱;DNA Molecular Profiling:A New Approach to Quality Control of Chinese Drugs[J];Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine;2000年01期
5 ;DNA REPAIR CAPACITY IN LUNG CANCER PATIENTS[J];癌变.畸变.突变;2001年04期
6 黄力拉,朱刚劲;被拐卖及失踪儿童采血验DNA前的心理问题及对策[J];齐齐哈尔医学院学报;2001年03期
7 安小惠 ,王一理 ,来宝长 ,耿一萍 ,司履生;CONSTRUCTION OF HUMAN INTERLUEKIN-18 DNA VACCINE AND IT'S EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS[J];Journal of Xi'an Medical University;2001年02期
8 ;A Study of PCR with DNA Extracted from Single Cell Isolated from Histological Sections[J];遵义医学院学报;2001年01期
9 王军阳,范桂香,胜利,袁育康;THE CONSTRUCTION AND PRELIMINARY APPRAISEMENT OF HSV-2 gD GENE DNA VACCINE[J];Academic Journal of Xi'an Jiaotong University;2002年02期
10 董菁 ,成军 ,王勤环 ,施双双 ,王刚 ,斯崇文;CLONING AND ANALYSIS OF THE GENOMIC DNA SEQUENCE OF AUGMENTER OF LIVERR EGENERATION FROM RAT[J];Chinese Medical Sciences Journal;2002年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 Michael J.Siefkes;Cory O.Brant;Ronald B.Walter;;A novel real-time XL-PCR for DNA damage detection[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
2 ;Hormonal Regulation and Tumorigenic Role of DNA Methyltransferase[A];2011中国妇产科学术会议暨浙江省计划生育与生殖医学学术年会暨生殖健康讲习班论文汇编[C];2011年
3 Dongmei Zhao;Fan Jin;Yuli Qian;Hefeng Huang;;Expression patterns of Dnmtl and Dnmt3b in preimplantational mouse embryos and effects of in-vitro cultures on their expression[A];中华医学会第十次全国妇产科学术会议妇科内分泌会场（妇科内分泌学组、绝经学组、计划生育学组）论文汇编[C];2012年
4 姜东成;蒋稼欢;杨力;蔡绍皙;K.-L.Paul Sung;;在聚吡咯微点致动下的DNA杂交行为[A];2008年全国生物流变学与生物力学学术会议论文摘要集[C];2008年
5 白明慧;翁小成;周翔;;联邻苯二酚类小分子作为DNA交联剂的研究[A];第六届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2009年
6 张晔;杜智;杨斌;高英堂;;检测外周血中游离DNA的应用前景(综述)[A];天津市生物医学工程学会第29届学术年会暨首届生物医学工程前沿科学研讨会论文集[C];2009年
7 周红;郑江;王良喜;丁国富;鲁永玲;潘文东;罗平;肖光夏;;CpG DNA诱导全身炎症反应综合征的作用及其机制研究[A];全国烧伤创面处理、感染专题研讨会论文汇编[C];2004年
8 ;EFFECTS OF Ku70-DEFICIENT ON ARSENITE-INDUCED DNA DOUBLE STRAND BREAKS, CHROMOSOMAL ALTERATIONS AND CELL CYCLE ARREST[A];海峡两岸第三届毒理学研讨会论文摘要[C];2005年
9 李经建;冀中华;蔡生民;;小沟结合方式中的DNA媒介电荷转移[A];第十三次全国电化学会议论文摘要集（下集）[C];2005年
10 ;The interaction between Levofloxacine Hydrochloride and DNA mediated by Cu~(2+)[A];湖北省化学化工学会2006年年会暨循环经济专家论坛论文集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 袁满;平安：把“领先”作为DNA[N];经济观察报;2006年
2 舒放;编织一个DNA纳米桶[N];医药经济报;2006年
3 闫洁;英两无罪公民起诉要求销毁DNA记录[N];新华每日电讯;2008年
4 何德功;日本制成诊断鱼病的“DNA书”[N];农民日报;2004年
5 本报记者 张巍巍;DNA样本也能作假[N];科技日报;2009年
6 周斌伟 邹巍;苏州警方应用DNA技术一年侦破案件1887起[N];人民公安报;2011年
7 本报记者 杨天笑;揭秘“神探”DNA[N];苏州日报;2011年
8 第四军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室教授 李福洋;破除法老DNA的咒语[N];东方早报;2011年
9 常丽君;DNA电路可检测导致疾病的基因损伤[N];科技日报;2012年
10 常丽君;效率和质量：“DNA制造业”两大障碍被攻克[N];科技日报;2012年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 唐阳;基于质谱技术的基因组DNA甲基化及其氧化衍生物分析[D];武汉大学;2014年
2 池晴佳;DNA动力学与弹性性质研究[D];重庆大学;2015年
3 胡璐璐;哺乳动物DNA去甲基化过程关键酶TET2的三维结构与P暬蒲芯縖D];复旦大学;2014年
4 马寅洲;基于滚环扩增的DNA自组装技术的研究[D];南京大学;2014年
5 黄学锋;精子DNA碎片的临床意义：临床和实验研究[D];复旦大学;2013年
6 隋江东;APE1促进DNA-PKcs介导hnRNPA1磷酸化及其在有丝分裂期端粒保护中的作用[D];第三军医大学;2015年
7 刘松柏;结构特异性核酸酶FEN1在DNA复制及细胞周期过程中的功能性研究[D];浙江大学;2015年
8 王璐;哺乳动物中亲本DNA甲基化的重编程与继承[D];中国科学院北京基因组研究所;2015年
9 齐文靖;染色质改构蛋白BRG1在DNA双链断裂修复中的作用及机制研究[D];东北师范大学;2015年
10 龙湍;水稻T-DNA插入突变群体侧翼序列的分离分析和OsaTRZ2的克隆与功能鉴定[D];华中农业大学;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 董洪奎;面向可视化纳米操作的DNA运动学建模及误差实时校正方法[D];沈阳理工大学;2014年
2 闻金燕;水溶性羧基和吡啶基咔咯大环与DNA和人血清蛋白的相互作用[D];华南理工大学;2015年
3 江怿雨;水溶性羧酸卟啉及其配合物与DNA和人血清蛋白的相互作用[D];华南理工大学;2015年
4 高志森;比较外周游离循环肿瘤DNA与癌胚抗原监测非小细胞肺癌根治术前后肿瘤负荷变化的初步研究[D];福建医科大学;2015年
5 丁浩;血浆循环DNA完整性及多基因甲基化对肺癌诊断价值的研究[D];河北大学;2015年
6 王鹏;基于碳点@氧化石墨烯复合材料DNA生物传感器的构建及用于PML/RARα基因检测[D];福建医科大学;2015年
7 李海青;转碱篷和盐角草总DNA的耐盐紫花苜蓿的选育[D];内蒙古大学;2015年
8 李婷婷;小鼠DNA模式识别重要受体的分子结构特征及其功能研究[D];中国农业科学院;2015年
9 刘瑞斯;抗癌药物奥沙利铂与DNA相互作用的原子力显微镜观察研究[D];东北林业大学;2015年
10 熊忠;芳香二肽与一价金属离子间相互作用及DNA切割活性的研究[D];郑州大学;2015年
，本文编号：1273120
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/1273120.html
