化痰散结法干预Graves病小鼠甲状腺肿大与功能亢进的免疫调控研究

发布时间：2017-12-10 07:17

本文关键词：化痰散结法干预Graves病小鼠甲状腺肿大与功能亢进的免疫调控研究

【摘要】：Graves病(Gravesdisease,GD)是一种自身免疫性甲状腺疾病,在西方国家发病率达0.5%～2%,国内发病率为2%～3.0%,并有逐年上升的趋势。GD特征主要为甲状腺肿大和甲状腺功能亢进,与免疫紊乱密切相关。导师认为:甲肿为有形之物,属中医"痰浊",功能亢进属中医"火旺",GD的基本病机为"痰火凝结于颈前"。基于此病机提出"化痰散结、清热消瘿"的治疗思想,并构建了以夏枯草、玄参、土贝母等为主药的GD治疗基本方法,经20余年的临床验证,具有良好的疗效。相关研究先后获得三次国家自然科学基金资助,本研究来源于导师国家自然科学基金项目"化痰散结法对Graves病小鼠模型甲状腺肿大与激素合成下游事件的影响"(项目批准编号:81373593),从GD甲状腺肿大、甲状腺功能亢进及免疫紊乱三个方面开展化痰散结法的研究,以期探索三者之间的关系和化痰散结法的作用特点。目的研究化痰散结法对GD小鼠甲状腺肿大及功能亢进的影响,并从免疫紊乱、增殖与凋亡失衡、甲状腺激素合成下游事件等方面探讨其作用机制。方法1.GD小鼠模型制备及分组:将雌性BALB/c小鼠随机分为正常对照组(Normal)、空载病毒对照组(Ad-Control)和重组腺病毒组(Ad-TSHR289)3组,Ad-TSHR289组采用含有TSHR-A亚单位的重组腺病毒,对BALB/c小鼠进行胫前肌肉注射免疫,分别于实验第1、4、7周进行,共免疫三次,诱导GD小鼠模型,每次免疫诱导前均对重组腺病毒进行侵染力检测。Ad-Control组注射空载病毒,Normal组注射等体积PBS溶液,免疫方式与Ad-TSHR289组相同。第10周时检测小鼠血清T4及TRAb,当成模率大于70%后进行后续实验。将造模阶段Normal组和Ad-Control组小鼠继续保留,成模后的小鼠随机分为3组:GD模型组(GD);化痰散结中药组(HTSJ);甲巯咪唑组(MMI)。对HTSJ组小鼠采用化痰散结中药干预,MMI组选取甲巯咪唑干预,其余组给予等体积蒸馏水,药物剂量按照人与动物药物剂量换算得出,灌胃给药4周后,留取各组小鼠血清、脾脏、甲状腺组织样本,进行后续实验。2.GD小鼠模型甲状腺分泌功能的测定:用放免法检测各组小鼠血清T4与TRAb,观察化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺功能的影响。3.GD小鼠模型甲状腺组织形态观察:称量各组小鼠体重及甲状腺重量,计算小鼠甲状腺指数(甲状腺重量/体重),采用体式显微镜观测各组小鼠甲状腺形态改变,采用光镜观测各组小鼠经HE染色的甲状腺组织结构改变,采用电子透射电镜观测各组小鼠甲状腺超微结构的改变,观察化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺形态的影响。4.GD小鼠模型甲状腺激素合成下游事件的分子检测:采用RT-PCR法及Westen Blot法检测各组小鼠甲状腺组织中NIS、TPO与Tg基因及蛋白的表达改变,观察化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺素合成过程的影响。5.GD小鼠模型甲状腺细胞增殖与凋亡检测:采用免疫组化法检测各组小鼠甲状腺细胞增殖核抗原(PCNA)、凋亡特异性蛋白Fas/FasL、Bcl-2/Bax的改变,观察化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺细胞增殖与凋亡的影响。6.GD小鼠模型脾脏淋巴细胞Treg/Th17检测:分析采用四色荧光标记流式细胞技术检测各组小鼠CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞和CD4+IL-17+ Th17细胞在脾脏淋巴细胞中的比例,采用RT-PCR法检测各组小鼠脾脏淋巴细胞中Foxp3mRNA与IL-17mRNA表达的改变,观察化痰散结法对GD小鼠模型免疫紊乱的影响。结果1.成功制备GD小鼠模型:Ad-TSHR289组小鼠血清T4为230.16±41.01ng/ml,较Normal 组升高 152.90%(P=0.000);血清 TRAb 为 12.34±3.51u/l,较 Normal 组升高1423.46%(P=0.000)。所有Ad-TSHR289组小鼠的血清T4及TRAb均超过Normal组的正常上限,小鼠总成模率为100%。2.化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺分泌功能的影响:HTSJ组小鼠血清T4为181.46±47.69ng/ml,较G0组下降了18.73%(P=0.021);TRAb为10.55±2.37u/l,较G0组下降了 35.47%(P=0.000)。3.化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺形态学的作用:HTSJ组小鼠甲状腺指数为(3.189±1.220)×10-4,较GD组下降了 41.69%(P=0.000),甲状腺充血得到改善。甲状腺滤泡腔内的乳头状凸起减少,甲状腺滤泡上皮细胞增生及肥大得到改善,高柱状细胞形态逐渐向扁平状恢复,滤泡腔内的胶质较GD组增加。甲状腺滤泡上皮细胞内的线粒体数目减少,内质网池的扩张减轻,线粒体肿胀缓解,线粒体嵴较GD组清晰,细胞内的内吞胶质滴数目较GD组减少。4.化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺激素合成下游事件的影响:HTSJ组小鼠甲状腺细胞中的NISmRNA及蛋白表达分别下降78.80%(P=0.003)和45.97%(P=0.000);TPOmRNA 及蛋白表达分别下降 72.85%(P=0.000)和 66.24%(P=0.000);TgmRNA及蛋白表达分别下降81.06%(P=0.000)和62.79%(PP=0.000)。5.化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺细胞增殖与凋亡的影响:HTSJ组小鼠甲状腺组织的PCNA阳性的甲状腺滤泡上皮细胞较GD组减少,Fas阳性、FasL阳性的甲状腺滤泡上皮细胞较GD组增加,Bax阳性的甲状腺滤泡上皮细胞较GD组增加,Bcl-2阳性的甲状腺滤泡上皮细胞较GD组无明显改变。6.化痰散结法对GD小鼠模型免疫功能的影响:HTSJ组小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的比例较GD组上升73.62%(P=0.037);脾脏淋巴细胞中Foxp3mRNA的表达较GD组上升 186.67%(P=0.010),IL-17mRNA的表达下降了 71.27%(P=0.003)。结论1.化痰散结法能够有效改善GD小鼠甲状腺功能亢进,减轻甲状腺肿大。2.化痰散结法的作用机制可能是通过上调GD小鼠CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的比例,升高Foxp3mRNA的表达,降低IL-17mRNA的表达,调节GD小鼠的免疫紊乱,减少TRAb的产生,从而:①降低甲状腺素合成过程中NIS、TPO、Tg的表达,达到减少甲状腺素合成的目的;②抑制甲状腺细胞增殖,加速甲状腺细胞凋亡,达到减轻甲肿的目的。通过对GD小鼠甲状腺肿大、甲状腺功能亢进以及免疫紊乱三方面的综合调控,最终起到治疗GD的目的。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R259

【参考文献】

中国期刊全文数据库前10条

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