自噬在吉非替尼肝脏毒性中的作用及其机制研究

发布时间：2017-12-10 23:27

  本文关键词：自噬在吉非替尼肝脏毒性中的作用及其机制研究

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【摘要】：研究目的:吉非替尼(Gefitinib)是目前临床应用最广泛的酪氨酸激酶抑制剂之一,但其严重的肝脏毒性常造成部分患者中断治疗,甚至导致个别患者的死亡。而目前针对其毒性机制尚无研究报道,更缺乏有效的干预手段。我们前期研究发现,Gefitinib可通过诱导肝细胞凋亡导致肝脏毒性,自噬可能参与该毒性发生过程。本课题旨在探索自噬在Gefitinib肝脏毒性中的作用,阐明自噬与凋亡之间的相互关系,并基于此研究干预Gefitinib肝脏损伤的新策略,拓展其临床应用。研究方法:第一部分:自噬在Gefitinib肝脏毒性中的作用研究(1)建立Gefitinib肝脏毒性ICR小鼠模型,通过肝脏脏器指数,血液生化指标谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)以及苏木精-伊红染色法(HE)分析病理切片,确证Gefitinib肝脏毒性的发生;(2)肝脏组织免疫组化和TUNEL染色实验确证肝脏组织中肝细胞凋亡发生情况;(3)采用SRB染色法检测Gefitinib对人正常肝细胞HL7702(L02)的增殖抑制能力;(4)Western blot、DAPI染色和Annexin V/PI双染结合流式细胞术实验检测凋亡发生情况;(5)免疫透射电镜(TEM)、western blot、免疫组化和丫啶橙(AO)染色结合流式细胞术实验检测体内外自噬发生情况;(6)采用特异性Caspase泛抑制剂Z-VAD-FMK抑制凋亡,结合western blot、PI染色结合流式细胞术考察抑制细胞凋亡对自噬的影响;(7)采用小分子RNA干扰技术沉默Atg5,结合western blot、PI染色结合流式细胞术考察抑制细胞自噬对凋亡的影响;(8)采用cre-loxp系统建立肝脏特异性敲除自噬关键基因Atg7的转基因小鼠模型,并结合肝脏脏器指数、血液生化指标、HE病理切片以及免疫组化等实验手段考察自噬与Gefitinib肝脏损伤的关系,以及初步确证自噬对肝细胞凋亡的调控作用。第二部分:Gefitinib介导的自噬调控肝细胞凋亡的分子机制研究(1)应用TMT定量蛋白质组学分析寻找并确证Gefitinib诱导自噬降解的关键蛋白;(2)采用溶酶体抑制剂氯喹(CQ)抑制自噬,结合western blot验证Gefitinib诱导自噬降解的可能底物蛋白;(3)采用小分子RNA干扰技术沉默Atg5,以排除小分子抑制剂脱靶效应,结合western blot确证Gefitinib诱导自噬降解的底物蛋白为COX6A1;(4)根据电镜结果,统计对照组与给药组小鼠肝细胞内线粒体数目,western blot检测线粒体基质蛋白Hsp60和膜蛋白Tomm20,考察线粒体数目的变化;(5)分离肝细胞内线粒体,western blot检测Gefitinib作用下胞浆和线粒体中COX6A1蛋白水平的变化;(6)Western blot检测Gefitinib不同浓度和时间作用下肝细胞L02中COX6A1蛋白水平的变化;(7)Western blot检测ICR小鼠肝脏中Gefitinib作用下COX6A1蛋白水平的变化;(8)构建过表达COX6A1细胞,结合western blot和PI染色结合流式细胞术考察过表达COX6A1对肝细胞凋亡的影响;(9)采用 real-time PCR(RT-PCR)实验考察 Gefitinib 对 COX6A1 mRNA 水平的影响;(10)采用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)与Gefitinib共同作用,结合western blot考察Gefitinib对COX6A1蛋白合成水平的影响;(11)采用蛋白酶体抑制剂MG132与Gefitinib共同作用,结合western blot考察泛素蛋白酶体通路在COX6A1蛋白下调中的作用;(12)采用选择性PI3K抑制剂3-MA抑制自噬,结合western blot考察自噬溶酶体通路在Gefitinib诱导COX6A1下调中的作用;(13)采用自噬关键基因Atg5、Atg7敲除的MEF细胞,自噬关键基因Atg7敲除的肝脏组织,进一步考察自噬溶酶体通路在Gefitinib干预COX6A1蛋白稳定性中的作用。第三部分:Gef-itinib诱导肝细胞自噬发生的机制及其干预策略研究(1)采用 SRB 染色法、western blot 考察 Gefitinib、Erlotinib 和 Afatinib 作用下肝细胞中COX6A1蛋白水平的变化;(2)采用小分子RNA干扰技术沉默肝细胞中表皮生长因子受体(EGFR)蛋白,结合western blot考察肝细胞中COX6A1、c-PARP和LC3蛋白水平的变化,探讨Gefitinib作用靶点EGFR在其自噬中的作用;(3)采用western blot考察在Gefitinib作用后PLK1蛋白水平的变化;(4)采用RT-PCR考察Gefitinib对PLK1mRNA水平的影响;(5)肝组织切片进行HE染色和免疫组化实验考察PLK1与损伤部位共定位情况;(6)通过ICR小鼠模型,采用血液生化指标和western blot检测确定PLK1蛋白水平变化与Gefitinib诱导肝脏损伤发生时间先后关系;(7)沉默和过表达PLK1蛋白,结合western blot考察其与Gefitinib诱导的肝细胞自噬之间的关系;(8)Western blot检测PLK1抑制剂BI-2536对Gefitinib诱导的肝细胞自噬的影响;(9)PI染色结合流式细胞术考察PLK1抑制剂BI-2536对Gefitinib诱导的肝细胞凋亡的影响;(10)采用ICR小鼠模型,结合肝脏脏器指数,血液生化指标和HE病理切片检测,研究PLK1抑制剂BI-2536在体内对Gefitinib肝脏毒性的保护作用;(11)采用肺癌细胞PC9、H1299和H460,采用SRB染色法检测PLK1抑制剂BI-2536对Gefitinib抗肿瘤药效的影响。研究结果:第一部分:细胞自噬在Gefitinib肝脏毒性中的作用研究(1)体内外实验证实Gefitinib诱导肝细胞凋亡Gefitinib200mg/kg灌胃给于ICR小鼠4周后,出现了与临床报道一致的肝脏功能紊乱。肝脏脏器指数与对照组比明显升高,从对照组的4.05 ±0.33%升高到Gefitinib给药组的5.24 ± 0.61%。Gefitinib给药组血清中的ALT、AST和LDH含量是对照组的2～10倍。Gefitinib给药组肝脏切片进行HE染色,结果显示肝脏出现嗜酸性变。进一步采用免疫组化法检测肝脏组织切片中cleaved-PARP(c-PARP)蛋白的表达情况,发现损伤部位c-PARP明显升高。TUNEL染色结果也显示Gefitinib给药组小鼠肝组织切片中,绿色荧光强度明显增加。以上结果表明Gefitinib诱导肝细胞凋亡可能是其诱导损伤的原因。SRB染色法实验证实Gefitinib可显著抑制肝细胞L02增殖能力,计算得出IC50为19.9μM。Annexin V/PI双染结合流式细胞术检测细胞死亡方式,结果显示,肝细胞凋亡比例随Gefitinib给药浓度或时间的增加而增加。DAPI染色结果显示Gefitinib作用后细胞核出现了典型的凋亡特征,细胞核明显固缩,同时出现凋亡小体。Westernblot结果显示,Gefitinib作用后肝细胞内凋亡相关蛋白PARP切割片段c-PARP明显增加。以上结果从体内外证实Gefitinib通过诱导肝细胞凋亡,进而引发肝脏毒性。(2)体内外实验证实Gefitinib诱导肝细胞凋亡的同时诱导细胞自噬采用免疫透射电镜实验发现Gefitinib组小鼠肝脏组织出现典型自噬泡结构。Western blot结果也表明Gefitinib给药组小鼠肝脏组织中自噬标记蛋白LC3 Ⅰ型向LC3 Ⅱ型转换明显增加。采用免疫组化法检测Gefitinib组小鼠肝脏组织切片中LC3蛋白的表达情况,发现损伤部位LC3明显升高且成点状聚集。进一步在体外肝细胞L02中,免疫透射电镜也检测到Gefitinib作用后出现的自噬泡结构。AO染色结合流式细胞术检测结果显示,Gefitinib不同浓度0 μM、5 μM、10 μM和20 μM和Gefitinib20μM浓度下不同时间0、6、12和24小时对应的AO阳性细胞率分别为14.01 ± 3.22%、19.78 ± 1.51%、21.34 ± 5.97%、37.46 ± 4.07%和 14.88 ± 0.63%、16.76 ± 3.80%、24.40 ± 1.95%、40.01 ±7.67%,AO 阳性细胞比例随 Gefitinib 给药浓度或时间的增加而增加。Western blot结果显示Gefitinib组肝细胞自噬标记蛋白LC3Ⅰ型向LC3Ⅱ型转换明显增加。以上结果从体内外证实,Gefitinib诱导肝细胞凋亡同时诱导自噬。(3)Gefitinib介导的自噬是其肝细胞凋亡依赖的肝脏毒性的关键原因采用Caspase泛抑制剂Z-VAD-FMK抑制Gefitinib引起的肝细胞凋亡,PI染色结合流式细胞术结果显示,肝细胞凋亡率从52.95±20.70%降至20.59±18.50%。而SRB染色实验和western blot结果显示,抑制肝细胞凋亡并不影响Gefitinib诱导的自噬发生和细胞数目减少。采用小分子RNA干扰技术沉默自噬关键蛋白Atg5的表达,western blot实验结果显示,抑制自噬可以逆转Gefitinib引起的c-PARP增加。SRB染色实验结果显示,抑制自噬后细胞存活率从Gefitinib作用后的55.12±4.58%回升到86.41 ±0.81%。PI染色结合流式细胞术结果显示,抑制自噬后肝细胞肝细胞凋亡率从57.22± 11.25%降至24.72±4.17%。以上结果初步说明抑制自噬可以抑制Gefitinib引起的肝细胞凋亡,进而逆转Gefitinib肝脏毒性。进一步采用肝脏特异性敲除自噬关键基因Atg7的转基因小鼠模型,肝脏脏器指数、血液生化指标和HE病理切片结果显示,抑制自噬可以保护Gefitinib引起的肝毒性。肝脏免疫组化结果显示,抑制自噬可以抑制Gefitinib引起的肝细胞凋亡。以上结果从体内外证实自噬是Gefitinib引起肝细胞凋亡,进而导致肝脏毒性的关键原因。第二部分:Gefitinib介导的自噬调控肝细胞凋亡的分子机制研究(1)TMT定量蛋白质组学发现COX6A1是Gefitinib介导自噬降解的底物蛋白Western blot结果显示,CQ作用下蛋白LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ型转换明显增加,说明CQ抑制自噬溶酶体以及其包含蛋白的降解。我们将对照组,Gefitinib给药组和Gefitinib + CQ组进行TMT定量蛋白质组学分析,质谱鉴定得到6448个差异蛋白。我们对变化倍数大于1.3的蛋白进一步进行分析,Gefitinib作用下蛋白水平下降的有36个,合用CQ后蛋白水平回升的有18个,在两者中相同的蛋白有3个,分别为B2M,COX6A1和TUBB8。Western blot结果显示,Gefitinib引起的这三个蛋白的降解均能够被CQ逆转。进一步采用小分子RNA干扰技术沉默Atg5抑制自噬,只有COX6A1能够被逆转,B2M和TUBB8则不可以,说明CQ所逆转B2M和TUBB8是自噬溶酶体途径非依赖的。统计电镜实验中对照组和给药组小鼠肝细胞内线粒体数目,结果显示两者没有显著变化。同时western blot结果显示给予Gefitinib不影响线粒体基质蛋白Hsp60和线粒体膜蛋白Tomm20蛋白水平。分离线粒体与细胞浆,western blot结果显示,Gefitinib作用后线粒体内COX6A1蛋白水平显著下降。给予肝细胞L02不同浓度和时间的Gefitinib,western blot结果显示,COX6A1蛋白水平的下调具有浓度和时间依赖性。ICR小鼠肝脏组织中,Gefitinib作用下COX6A1蛋白水平也显著下降。以上结果表明,COX6A1可能是Gefitinib介导自噬降解的底物蛋白。(2)COX6A1蛋白参与调控Gefitinib介导的肝细胞凋亡构建过表达COX6A1蛋白的肝细胞,给予Gefitinib作用24小时。Western blot结果显示,过表达COX6A1能够逆转Gefitinib引起的c-PARP增加。PI染色结合流式细胞术检测显示,过表达COX6A1能够减少Gefitinib引起的肝细胞凋亡,肝细胞凋亡率从Gefitinib给药后的53.89 ± 14.27%降到28.39 ± 3.46%。以上结果说明,COX6A1可能是Gefitinib诱导肝细胞凋亡的关键原因。(3)Gefitinib作用下COX6A1蛋白经由自噬溶酶体途径降解采用RT-PCR检测,结果显示Gefitinib作用下,COX6A1mRNA水平并不随着时间浓度变化而变化,说明Gefitinib不影响COX6A1转录水平。采用蛋白合成抑制剂CHX结合western blot结果显示,Gefitinib不影响COX6A1的蛋白合成水平,提示蛋白降解途径参与Gefitinib诱导的COX6A1下调。通过泛素蛋白酶体抑制剂MG132证实Gefitinib作用下COX6A1的下调不经由泛素蛋白酶体途径。采用选择性PI3K抑制剂3-MA抑制自噬,western blot结果显示,Gefitinib诱导的COX6A1蛋白下调能够被逆转,初步证实COX6A1经由自噬溶酶体途径降解。进一步对敲除自噬关键基因Atg5以及Atg7的MEF细胞,自噬关键基因Atg7敲除的肝脏组织的运用,确证了 Gefitinib诱导COX6A1经由自噬溶酶体通路降解。第三部分:Gefitinib诱导自噬发生的机制及其干预策略研究(1)Gefitinib激活的肝细胞自噬不依赖于其靶点EGFR采用其他EGFR抑制剂Erlotinib和Afatinib考察Gefitinib介导的COX6A1自噬降解是否是其靶点效应,通过SRB染色法确定Erlotinib和Afatinib在肝细胞上作用浓度分别为20 μM和5 μM,western blot结果显示,仅在Gefitinib作用下COX6A1蛋白下调,而Erlotinib和Afatinib作用下不变。进一步采用小分子RNA干扰技术沉默EGFR,western blot结果显示沉默EGFR也不引起肝细胞内COX6A1蛋白的下调,且沉默EGFR并不影响Gefitinib诱导自噬的发生和细胞凋亡的发生。(2)PLK1调控Gefitinib诱导的肝细胞自噬采用western blot检测PLK1在Gefitinib作用下变化情况,结果显示,PLK1随Gefitinib作用浓度和时间的增加而增加。同时在原代肝细胞中也观察到相同现象。采用RT-PCR检测,结果显示Gefitinib作用下,PLK1 mRNA水平随着时间浓度变化而变化,说明Gefitinib通过影响PLK1转录水平增加其蛋白表达。采用HE染色结合免疫组化进一步分析,结果显示,在肝细胞损伤部位PLK1表达显著升高。体内ICR小鼠不同时间的血清及肝脏组织结果显示,Gefitinib给药后血液生化指标在第三周才开始出现变化,而肝脏中PLK1蛋白水平则在第二周出现明显升高。以上结果说明肝细胞中PLK1蛋白水平在Gefitinib给药后显著升高,并且早于肝损伤的发生,提示PLK可能与Gefitinib诱导的肝脏损伤存在着密切的关系。采用小分子RNA干扰技术沉默PLK1表达,western blot结果显示沉默PLK1可以显著抑制Gefitinib引起的肝细胞自噬,而过表达PLK1蛋白则会引起肝细胞自噬。以上结果说明,Gefitinib可通过上调PLK1,进而诱导肝细胞自噬,最终引起肝脏毒性。(3)PLK1抑制剂干预Gefitinib肝脏毒性研究前期结果提示PLK可能是Gefitinib肝脏毒性的干预靶点。我们采用PLK1抑制剂BI-2536与Gefitinib进行合用,westernblot结果显示BI-2536可以抑制Gefitinib引起的肝细胞LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ型转换。PI染色结合流式细胞术检测显示,BI-2536可以抑制Gefitinib引起的肝细胞凋亡,凋亡率从Gefitinib作用后的47.78 ±13.41下降到30.43 ± 5.96%。体内ICR小鼠实验结果显示,BI-2536可以使肝脏脏器指数回到正常水平,从Gefitinib给药组的5.11 ±0.38%回到4.22 ±0.25%。同时BI-2536还可逆转Gefitinib引起的肝脏血液生化指标的升高。肝组织HE染色结合免疫组化实验结果显示,BI-2536通过抑制体内肝细胞自噬,进而抑制肝细胞凋亡,最终阻止Gefitinib肝脏毒性的发生。为了进一步验证PLK1抑制剂作为Gefitinib肝脏毒性干预策略的临床可行性,我们考察了 BI-2536对Gefitinib抗肿瘤药效的影响。在Gefitinib敏感细胞株非小细胞肺癌PC9,以及不敏感的肺癌细胞H1299和H460中,合用BI-2536不影响Gefitinib的抗肿瘤效应。以上结果说明,BI-2536在对抗Gefitinib肝脏毒性的同时,不会影响其抗肿瘤效果。研究结论:自噬是肝细胞凋亡依赖的Gefitinib肝脏毒性的关键原因。自噬促使线粒体相关蛋白COX6A1发生自噬溶酶体途径降解,进而引起肝细胞凋亡。PLK1参与调控Gefitinib引起的肝细胞自噬,PLK1抑制剂BI-2536可以在不影响Gefitinib抗肿瘤作用的同时改善Gefitinib引起的肝脏损伤。通过本课题的研究阐明了 Gefitinib肝脏毒性的发生机制,为临床Gefitinib的广泛应用及其肝脏毒性的防治提供了有效可行的策略。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】

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1 Po-Yuan Ke;Steve S-L Chen;;Autophagy in hepatitis C virus-host interactions:Potential roles and therapeutic targets for liver-associated diseases[J];World Journal of Gastroenterology;2014年19期

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本文编号：1276316