23kD肝再生增强因子对人肾小管上皮细胞自噬水平的调节作用

发布时间：2017-12-12 06:12

  本文关键词：23kD肝再生增强因子对人肾小管上皮细胞自噬水平的调节作用

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【摘要】：第一部分构建稳定下调23k D肝再生增强因子表达的人肾小管上皮细胞株目的:通过慢病毒感染人肾小管上皮细胞(HK-2)及嘌呤筛选的方法,构建稳定下调23k D肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)表达的人肾小管上皮细胞株。方法:设计针对人ALR基因的si RNA干扰靶点序列,构建特异性干扰人ALR表达的慢病毒sh RNA/ALR,转染人肾小管上皮细胞(HK-2)细胞。慢病毒sh RNA/control转染HK-2细胞作为对照。通过不同浓度嘌呤霉素对HK-2细胞进行处理,确定嘌呤霉素的筛选浓度。通过实时荧光定量PCR及免疫印迹法检测人肾小管上皮细胞中23k D ALR的表达情况。MTS检测HK-2细胞的增殖能力。结果:序列对比确认慢病毒中ALR si RNA寡核苷酸序列插入正确,嘌呤筛选浓度确认为3μg/ml。实时荧光定量PCR及免疫印迹检测显示,与正常组及sh RNA/control对照组比较,sh RNA/ALR组细胞内源性23k D ALR m RNA水平及蛋白表达显著减少(P0.05)。MTS结果显示,下调23k D ALR表达对HK-2细胞的增殖无明显影响(P0.05)。小结:成功构建了稳定下调23k D ALR表达的HK-2细胞株。第二部分I/R处理对HK-2细胞23k D ALR表达及自噬水平的影响目的:了解体外缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)处理对HK-2细胞23k D ALR表达及自噬相关蛋白表达的影响。方法:采用无糖无血清培养基结合缺氧复氧的方法对HK-2细胞进行处理。通过免疫印迹法检测HK-2细胞中23k D ALR表达变化及自噬相关蛋白LC3II及p62表达变化。免疫荧光观察HK-2细胞中LC3荧光光点表达情况。结果:免疫印迹实验证实I/R处理后HK-2细胞内23k D ALR表达升高,后逐渐降至正常。在I/R处理后3、6、12、24小时自噬相关蛋白LC3II表达均明显升高,自噬底物蛋白p62表达下降,免疫荧光结果提示I/R处理后HK-2细胞中LC3荧光明显增强。小结:在I/R过程中HK-2细胞ALR表达先升高,后恢复正常。HK-2细胞自噬水平先升高,后有所降低,但仍高于正常,体外I/R模型构建成功。第三部分下调23k D ALR表达对缺血再灌注诱导的HK-2细胞自噬水平的影响目的:探讨下调23k D ALR表达对缺血再灌注诱导人肾小管上皮细胞自噬水平的影响并探讨其作用机制。方法:用无糖无血清培养基结合缺氧复氧的方法对HK-2细胞进行处理,诱导HK-2细胞自噬。慢病毒sh RNA/ALR转染HK-2细胞下调了细胞中23k D ALR的表达。免疫印迹法检测ALR及自噬相关蛋白LC3II,p62,p-AMPK,AMPK,p-m TOR,m TOR,凋亡蛋白caspase-3的变化情况。激光共聚焦显微镜检测HK-2细胞LC3荧光的表达。流式细胞仪检测细胞内活性氧(reactive oxygen,ROS)水平。电镜检测HK-2细胞自噬小体的形成情况。流式细胞仪分析细胞凋亡水平。结果:免疫印迹法检测及荧光显微镜结果显示,与sh RNA/control对照组比较,sh RAN/ALR组细胞自噬水平在I/R后明显增高,细胞内自噬小体增多,细胞ROS水平显著增加。与sh RNA/control组相比,sh RNA/ALR组在缺血再灌注6小时(R6H)p-AMPK升高,p-m TOR降低。予以AMPK抑制剂Compound C对HK-2细胞进行处理后sh RNA/control组与sh RNA/ALR自噬水平下降,凋亡水平升高,在sh RNA/ALR组中更为明显。小结:23k D ALR参与了缺血再灌注诱导的HK-2细胞自噬过程,下调HK-2细胞23k D ALR表达可以使自噬水平升高,而这一作用与23k D ALR表达下调导致ROS水平升高,从而诱导AMPK-m TOR通路激活有关。而抑制自噬则使HK-2凋亡水平增加。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692

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本文编号：1281446