miR-27a-3p调控内皮细胞功能参与主动脉夹层血管重构的机制研究

发布时间：2017-12-12 06:32

  本文关键词：miR-27a-3p调控内皮细胞功能参与主动脉夹层血管重构的机制研究

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【摘要】：第一部分主动脉夹层miR-27a-3p的差异表达与分布目的观察miR-27a-3p在人主动脉组织中的表达与分布情况,初步探讨miR-27a-3p与主动脉夹层的相关性。方法1、通过qRT-PCR对人主动脉组织样本中miR-27a-3p、miR-27b、miR-217、miR-183、miR-20、miR-24的含量进行检测;2、免疫荧光原位杂交观察miR-27a-3p在人主动脉组织中的含量与分布,分析内皮细胞与miR-27a-3p共定位情况。结果1、与正常人主动脉组织相比,主动脉夹层组织样本中miR-27a-3p含量显著降低(P0.05),其余五种miRNA含量无显著改变;2、miR-27a-3p在人主动脉组织样本中主要与内皮细胞共定位分布在内膜层,主动脉夹层组织样本中miR-27a-3p的含量与内皮细胞的数量均显著低于正常人主动脉组织(P0.05)。结论主动脉夹层患者主动脉管壁组织中miR-27a-3p显著降低,同时伴有内皮细胞含量的减少,提示miR-27a-3p可能通过调控内皮细胞功能参与主动脉夹层病理过程。第二部分miR-27a-3p调控HUVEC功能及机制研究目的探讨miR-27a-3p对人脐静脉内皮细胞功能的调控,筛选miR-27a-3p调控的具体靶标与通路,明确miR-27a-3p的调控机制。方法1、构建干预HUVEC中miR-27a-3p的慢病毒并通过q RT-PCR与Western blotting检测其干预效果,并通过CCK-8与流式细胞仪检测HUVEC增殖与凋亡功能;2、蛋白芯片检测干预HUVEC中miR-27a-3p后与凋亡功能相关的蛋白含量变化特征,生物信息学分析初步筛选miR-27a-3p调控靶标与通路。双萤光素酶报告明确miR-27a-3p对FADD的直接调控作用,并通过q RT-PCR与Western blotting检测FADD及其他相关蛋白含量;3、利用RNA干扰技术构建干预FADD的转染质粒,同时干预HUVEC中的miR-27a-3p与FADD并用流式细胞仪检测HUVEC凋亡功能改变结果1、miR-27a-3p干预慢病毒对HUVEC干预效果明确,下调miR-27a-3p显著促进HUVEC凋亡功能,上调miR-27a-3p则显著抑制HUVEC凋亡功能(P0.05),而干预miR-27a-3p后对HUVEC增殖功能未观察到显著影响。2、蛋白芯片发现与凋亡通路密切相关的Caspase8、Caspase3、IGFBP-6、IGFBP-4、bcl-2、bax、TNF-alpha、IGF-II蛋白在下调miR-27a-3p组中有显著差异(P0.05)。双萤光素酶报告明确在凋亡通路中的关键蛋白FADD是miR-27a-3p直接调控的靶蛋白,q RT-PCR实验结果表明,下调miR-27a-3p能显著提高HUVEC中FADD的表达,上调miR-27a-3p则显著抑制HUVEC中FADD表达(P0.05)。Western blotting实验结果表明,下调miR-27a-3p的HUVEC中,FADD、Caspase8以及Caspase3均明显高表达,上调miR-27a-3p则显著抑制FADD、Caspase8以及Caspase3的表达(P0.05)3、相对于加入si RNA NC的对照组,下调HUVEC的miR-27a-3p组中加入FADD si RNA后能抑制其对凋亡的促进作用(P0.05)。结论miR-27a-3p直接抑制FADD的表达影响凋亡通路的功能进而抑制HUVEC的凋亡功能。第三部分miR-27a-3p调控HUVEC与HASMC相互作用及机制研究目的观察miR-27a-3p在HUVEC与HASMC相互作用中扮演的重要角色。方法利用Transwell板构建非接触性HUVEC与HASMC共培养模型,利用慢病毒干预HUVEC中的miR-27a-3p并进行共培养,通过流式细胞仪检测HASMC的凋亡情况,划痕实验与Transwell迁移实验检测HASMC迁移能力。通过蛋白芯片筛选共培养模型的上清液中与迁移功能相关的蛋白变化,挑选差异显著的GDF8与MMP20并通过ELISA实验验证其表达差异。结果1、干预HUVEC中的miR-27a-3p并与HASMC共培养后,划痕实验与Trasnwell迁移实验均发现下调HUVEC miR-27a-3p组能显著促进HASMC的迁移,而上调HUVEC miR-27a-3p则起到相反的效果(P0.05)。流式细胞仪检测到各组之间HASMC凋亡功能的差异无统计学意义(P0.05);2、蛋白芯片以1.2倍差异为阈值检测共培养模型上清液中差异蛋白,发现73个差异蛋白,进一步通过生物信息学分析并通过ELISA实验明确下调HUVEC miR-27a-3p组中GDF8表达显著增高而MMP20表达显著降低,上调HUVEC miR-27a-3p组中GDF8表达显著降低而MMP20表达显著升高(P0.05)。结论miR-27a-3p通过抑制HUVEC分泌GDF8同时促进HUVEC分泌MMP20抑制HASMC的迁移。第四部分miR-27a-3p影响主动脉夹层发生及血管重构的效果与机制目的观察miR-27a-3p对主动脉夹层的发生与血管重构的保护作用与机制。方法1、β-氨基丙腈结合血管紧张素II成功构建小鼠主动脉夹层模型,通过尾静脉注射体内干预miR-27a-3p后,q RT-PCR与Western blotting检测干预效果以及FADD、Caspase3、Caspase8、GDF8、MMP20的含量。同时通过主动脉大体形态及HE染色分析各组之间夹层发生率的差异以及主动脉形态学改变;2、TUNEL法结合CD31免疫荧光染色原位观察小鼠主动脉切片中内膜层内皮细胞凋亡情况,同时,利用免疫荧光进一步明确GDF8与MMP20在主动脉组织中的表达量与分布情况;3、利用EVG与MASSON染色分别观察主动脉中膜弹力纤维与胶原纤维在各组之间含量的变化。结果1、造模组造模成功率为63.3%,下调miR-27a-3p显著提高夹层造模成功率(93.3%),上调miR-27a-3p抑制夹层成功率至13.3%。分析HE染色切片发现,造模组的主动脉中膜厚度显著低于空白对照组,miR-27a-3p下调组中膜厚度与中膜管腔直径比显著低于其对照组,而miR-27a-3p上调组中膜厚度与中膜管腔直径比显著高于其对照组,差异均具有统计学意义(P0.05)。下调miR-27a-3p在m RNA与蛋白水平均显著上调FADD的表达,上调则有显著的抑制作用。下调miR-27a-3p在蛋白水平显著促进Caspase3与Caspase8表达,上调miR-27a-3p显著抑制二者的表达(P0.05)。虽然在m RNA水平中也观察到下调miR-27a-3p对Caspase3与Caspase8表达的促进作用(P0.05),但是上调miR-27a-3p则没有显著的调控效应,GDF8与MMP20的含量在m RNA水平也没有显著差异;2、下调miR-27a-3p能显著促进小鼠主动脉内膜层内皮细胞的凋亡,上调miR-27a-3p则显著抑制小鼠主动脉内膜层内皮细胞的凋亡(P0.05)。同时,相比于空白对照组,造模组小鼠主动脉内膜层内皮细胞的凋亡虽然有所增多,但是并未发现显著的统计学差异(P0.05)。免疫荧光结果发现造模组中GDF8显著多于空白对照组(P0.05),下调miR-27a-3p能显著促进GDF8的表达(P0.05),且GDF8主要表达在小鼠主动脉的中膜,上调miR-27a-3p则显著抑制GDF8的表达(P0.05),而与造模组相比,下调miR-27a-3p进一步促进GDF8的表达,上调则进一步抑制其表达(P0.05)。MMP20在下调miR-27a-3p组与造模组中显著下调,而上调miR-27a-3p则促进MMP20的表达(P0.05)。3、造模组中弹力纤维与胶原与空白对照组相比均显著降低(P0.05)。下调miR-27a-3p组的弹力纤维与胶原不仅相比其阴性对照组显著降低,与造模组相比也显著降低,而上调miR-27a-3p组则呈现相反的特征(P0.05)。结论miR-27a-3p通过抑制内皮细胞的凋亡,减少中膜层弹力纤维与胶原纤维的降解从而影响主动脉血管重构进而在主动脉夹层发生发展过程中具有保护作用。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.1

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