ACER2是一个新的通过促ROS产生而诱发自噬与凋亡的p53靶基因

发布时间：2017-12-12 13:29

  本文关键词：ACER2是一个新的通过促ROS产生而诱发自噬与凋亡的p53靶基因

  更多相关文章： ACER2 p53 DNA损伤 自噬 凋亡

【摘要】：碱性神经酰胺酶2(Alkaline ceramidase 2,ACER2)是一个定位于高尔基体膜上的七次跨膜蛋白,在除了胎盘的各种正常组织中广泛低表达,应对细胞刺激如DNA损伤、血清饥饿时表达明显上调。ACER2参与鞘磷脂的代谢,能催化神经酰胺水解生成鞘氨醇,鞘氨醇进一步磷酸化生成1磷酸鞘氨醇。ACER2可以通过控制神经酰胺、鞘氨醇及1磷酸鞘氨醇的相对水平进而在细胞的增殖、衰老、凋亡等过程中发挥作用以控制细胞的命运。我们课题组前期的研究工作已经鉴定了ACER2的转录起始位点并确定了ACER2基因的启动子。转录因子结合位点分析结果显示,ACER2基因的启动子含有Sp1、GATA-1和AP-1等潜在的转录因子结合位点。本研究在这一基础上,进一步对ACER2启动子区域重要的顺式作用元件进行分析,并进一步重点研究ACER2在细胞的自噬与凋亡中作用以及发挥功能的机制。(1)ACER2启动子区域重要转录因子结合位点的进一步分析采用UCSC基因组浏览器分析ACER2的基因组结构及基因组成,根据ENCODE组蛋白修饰数据及Chrom HMM染色体状态分割数据发现ACER2基因是活跃转录的。采用Mat Inspector专业版与TFSEARCH软件对ACER2的启动子区进行转录因子结合位点分析,发现有两个潜在的p53结合位点。这两个潜在的p53结合位点序列在人、大鼠和小鼠中具有一定的保守性,提示其在ACER2启动子的转录调控中起重要作用。(2)p53直接调节ACER2启动子的转录首先,将前期构建的各ACER2启动子报告基因系列删除体、后期构建的ACER2-P397启动子p53结合位点定点突变重组体以及p21、Bax的报告基因分别单独转染或与p53真核表达质粒共转染入H1299细胞,结果提示,p53过表达能够显著提高p21、Bax的报告基因的活性以及ACER2-P397、ACER2-P676、ACER2-P800及ACER2-P1285删除体的活性,但p53过表达对第一个p53结合位点的定点突变重组体的启动子活性的上调作用受到显著削弱甚至丧失,提示p53主要通过ACER2启动子区域中的第一个潜在的p53结合位点发挥对ACER2直接转录激活作用。同时,将p53过表达质粒转染入H1299细胞,定量QRT-PCR结果显示,p53的过表达可导致细胞内源性的ACER2的m RNA水平升高。采用ADR处理H1299与A549细胞,定量QRT-PCR结果显示,DNA损伤可使p53野生型的A549细胞内源性的ACER2的m RNA水平升高。然后将p53 si RNA转染入A549细胞,再联合ADR处理,定量QRT-PCR结果的显示,si RNA介导的p53表达抑制可导致细胞内源性的ACER2 m RNA水平降低。另外,染色质免疫沉淀分析(Ch IP)结果也证实,p53可以在体内结合在ACER2启动子核心区域的第一个潜在的p53结合位点。这些结果提示,p53可以直接调节ACER2启动子的转录,ACER2是一个新的p53靶基因。(3)ACER2诱发自噬与凋亡首先,将前期构建的ACER2真核表达质粒及p53表达质粒单独及联合转染入H1299细胞,wetern blot的结果分析表明,ACER2过表达能够上调LC3-II的表达,且与p53联合共转能诱发更强的LC3-II的上调;透射电镜的分析结果表明,ACER2过表达能够诱发自噬小体的增多,且与p53联合共转能诱发更多的自噬小体;免疫荧光及转染GFP-LC3质粒的实验结果分析表明,ACER2过表达能够诱发LC3-II斑点的增多,且与p53联合共转能诱发更多的LC3-II斑点;流式细胞术的实验结果表明,ACER2过表达后H1299细胞的凋亡数量增多,且与p53联合共转有助于p53诱发更多的细胞凋亡。我们将ACER2表达质粒转染入A549细胞并联合阿霉素(ADR)刺激,western blot与流式细胞术的实验结果表明,ACER2有助于DNA损伤诱发的细胞自噬与凋亡。然后我们将ACER2 si RNA及自噬的关键基因ATG5 si RNA转染入A549细胞,再联合ADR处理,western blot与流式细胞术的实验结果表明,DNA损伤诱发的自噬与凋亡需要ACER2基因。我们采用定点突变的方法构建ACER2蛋白N末端13、36个氨基酸残基分别缺失的删除体,将这两个删除体转染入H1299细胞中,western blot的结果分析表明,删除N末端13、36个氨基酸残基后也能诱发自噬。这些结果提示,ACER2能诱发自噬与凋亡,且有助于p53及DNA损伤诱发的自噬与凋亡。(4)ACER2通过产生ROS诱发自噬与凋亡我们采用NAC处理细胞后再将ACER2表达质粒转染入H1299细胞,流式细胞术的结果表明,NAC能够清除ACER2过表达产生的ROS;紧接着我们采用western blot及流式细胞术分别检测自噬与凋亡,发现使用NAC处理后ACER2诱发的自噬与凋亡明显减弱。然后我们将ACER2的表达质粒转染入H1299再联合H2O2处理,western blot及流式细胞术的结果分析表明,ACER2有助于H2O2诱发的自噬与凋亡。这些结果提示,ACER2通过产生ROS诱发自噬与凋亡。综上,我们的研究不仅发现ACER2启动子区域含有“明星基因”p53等重要的转录因子结合位点,而且进一步明确p53可以直接激活ACER2启动子的转录,并且可以调控内源性ACER2的表达。转录激活的ACER2能够诱发自噬与凋亡,且有助于p53及DNA损伤诱发的自噬与凋亡。DNA损伤诱发的自噬与凋亡需要ACER2基因的参与。明确了ACER2是通过鞘氨醇的积累产生更多ROS的机制诱发自噬与凋亡。本研究为进一步深入研究ACER2在细胞自噬与凋亡等过程的调控及肿瘤发生发展的调控机制和分子行为机制奠定一定的基础,对于丰富p53在鞘磷脂的代谢调控理论以及分子肿瘤学理论也均具有重要科学意义。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R363

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 欧阳军;;基因与长寿[J];家庭中医药;2006年10期

2 文辉;人到底有多少个基因?[J];百科知识;2003年11期

3 张丽华;侯振江;;p53基因在肺癌研究中的进展[J];临床肺科杂志;2006年01期

4 程鹏,童茂荣;p53基因在肺癌的治疗及预后中的价值[J];江苏医药;2000年03期

5 卢薇薇;仇容;;nm23基因的研究进展[J];中国实用医药;2008年30期

6 张爱菊;P~(53)基因与人类肿瘤[J];医学综述;1998年08期

7 熊建新,吴子忠;p53基因与肺癌[J];中国煤炭工业医学杂志;1999年01期

8 姚松朝;李辉;;p53基因与肺癌[J];海军医学;1995年01期

9 王武;卢辉山;;KAI1基因与消化道恶性肿瘤关系的研究现状[J];医学综述;2007年07期

10 马秀华,李翠萍,王建伟;Rb与P~(16)基因在肺癌组织中的表达及其意义[J];山东医药;1999年19期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 张蕊;Liang Zhao;Tom Gonda;;慢病毒介导的多西环素可诱导式短发夹RNA抑制K562细胞系e-myb基因的表达[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

2 高艳红;岳文;秦立鹏;张鹏;陈琳;裴雪涛;;人Spindlin1基因的功能初探[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

3 王卫东;陈正堂;李德志;;肿瘤治疗新策略——基因—放射治疗:原理、现状及展望[A];中华医学会放射肿瘤治疗学分会六届二次暨中国抗癌协会肿瘤放疗专业委员会二届二次学术会议论文集[C];2009年

4 王今达;;21世纪生命科学飞跃发展的基础——基因工程[A];2000年全国危重病急救医学学术会议论文集[C];2000年

5 李宝健;许新萍;冯道荣;范钦;朱华晨;林莉;;论改良生物体遗传性的多基因策略——Ⅰ.多基因改良策略将成为未来基因工程的主流方向[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

6 王根轩;;基因表达格局与植物数量性状的控制[A];全国植物分子生物学与生物技术学术研讨会论文集[C];2000年

7 彭志宏;黄柏胜;文芳;韩仰;刘发益;邬力祥;;Mettl9基因对U251细胞生长的影响及机制研究[A];湖南省生理科学会2013年度学术年会论文摘要汇编[C];2013年

8 付凌洁;张淑兰;;RASSF1A基因在卵巢癌中的表达及其对增殖、凋亡的影响[A];东北三省第四届妇产科学术会议论文汇编[C];2008年

9 钱伟;何云刚;赖建华;舒坤贤;谭德勇;余敏;;p53基因对mybbp1a(p160)基因的正调控作用研究[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年

10 薛世伟;林艳丽;熊福银;吴晓洁;周艳荣;郭虹敏;陈红星;陈树林;;人Nanog基因的克隆及其在CHO-K1细胞中的表达[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2010年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 全国政协委员 民盟中央委员 曹义孙;立法规范基因检测[N];团结报;2010年

2 吕回;鸟儿会唱人会说 只缘基因太相似[N];广东科技报;2004年

3 ;认识我们的基因[N];科技日报;2003年

4 本报记者 张丽;基因可以透视明天吗[N];中国消费者报;2001年

5 姜海;科学家发现新的致盲基因[N];科技日报;2007年

6 徐阳;基因与长寿[N];光明日报;2000年

7 记者 林小春 任海军;美国研究表明懒或许源于基因[N];新华每日电讯;2013年

8 卢菁;怕胖可就是管不住嘴,原是基因作怪[N];新华每日电讯;2008年

9 本报记者 卢雁妮;“从对生命及疾病本源的认识到基因科技造福人类”讲座开讲[N];黔西南日报;2014年

10 张小军;美发现老鼠性别新基因[N];医药经济报;2001年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 刘芳;RB94基因在非小细胞肺癌治疗中的作用及机制研究[D];山东大学;2015年

2 王宗丹;远程调控元件mbr选择性协调BCL2和NOXA基因转录活性的机制研究[D];南京医科大学;2013年

3 王晓乐;水稻脆鞘基因BSH1的图位克隆与功能分析[D];中国农业科学院;2015年

4 刘莉莉;奶牛产奶性状候选功能基因VPS28的功能验证[D];中国农业大学;2016年

5 王义涛;ACER2是一个新的通过促ROS产生而诱发自噬与凋亡的p53靶基因[D];重庆医科大学;2017年

6 廖传文;WTX基因调控肝癌细胞增殖及侵袭转移的机制研究[D];南昌大学;2016年

7 金旭;心血管内靶向定位基因递送体系—载基因支架的实验研究[D];中国协和医科大学;2006年

8 杨春霞;生活方式和基因多态与食道癌的关系[D];四川大学;2005年

9 吴汉林;人NIT1基因cDNA的克隆、原核表达及抗体制备[D];四川大学;2005年

10 何勇;p73基因在人肺癌中的表达及对其细胞生物学行为的影响[D];第三军医大学;2004年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 邓小冬;ERCC1、XPF和XPG基因在法医学年龄推断中的初步研究[D];川北医学院;2015年

2 张润贤;论基因权的私权属性及民法保护[D];东北林业大学;2015年

3 刘伟;家蚕受体酪氨酸激酶样的孤独受体Ror2基因功能的研究[D];苏州大学;2015年

4 卫姣;铜离子感应基因MAC1转录机理的研究[D];郑州大学;2015年

5 杨镇宇;禁食—恢复投喂条件下鲢神经肽Y及三个瘦素相关基因的表达分析[D];华中农业大学;2015年

6 周彦宽;Fam49b基因在人类细胞系中的定向敲除及其功能研究[D];浙江大学;2015年

7 刘如锦;病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ调控抗HIV-1基因APOBEC3G表达机制的初步探讨[D];杭州师范大学;2015年

8 罗萌萌;HEPIS基因功能的初步研究[D];华北理工大学;2015年

9 梁一丹;应用双荧光素酶报告载体研究上游开放阅读框的突变对靶基因的影响[D];南方医科大学;2015年

10 李霞;miRNA靶基因优选及网络分析[D];天津医科大学;2015年

，

本文编号：1282696