CTCF转录抑制miR-34a-5p及其在膀胱癌中的抑癌作用和分子机制研究

发布时间：2017-12-14 23:10

  本文关键词：CTCF转录抑制miR-34a-5p及其在膀胱癌中的抑癌作用和分子机制研究

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【摘要】：背景:膀胱癌是我国泌尿系肿瘤中发病率最高的一种,其死亡率也是泌尿系肿瘤中的首位,全国范围内,男性膀胱癌发病率居于所有男性恶性肿瘤第七位,女性膀胱癌的发病率则居于十五位以后。膀胱癌是源于尿路移行上皮细胞的癌症,大约三分之一的膀胱癌在诊断时就已经发生了局部浸润或远处转移。膀胱癌生物学行为复杂,易复发易转移,5年生存率只有62%,但是根治性膀胱癌切除仍然是治疗膀胱癌的金标准。如何通过分子机制的研究寻找诊断或治疗膀胱癌的新标志和新靶点,仍是目前膀胱癌研究的热点问题。microRNA(miRNA)是一种长度约为19～22nt的内源性非编码RNA,其主要作用就是在转录后水平调控基因的表达量。许多microRNA的表达量在不同的组织器官中,乃至不同的生理病理过程中都有特异性的表达差异。而在肿瘤中microRNA的特征性表达谱正是由于肿瘤中调控microRNA表达的相关因素发生了变化。作为经典的抑癌microRNA,miR-34a-5p在膀胱癌中的抑癌作用也已被证实,而其在膀胱癌中表达调控的机制尚不清楚。目的验证miR-34a-5p在膀胱癌细胞中的表达量,通过DNA甲基化的检测和寻找在膀胱癌中转录调控miR-34a-5p的因子,探讨膀胱癌中的miR-34a-5p的表达调控机制。并采用功能实验验证miR-34a-5p及其转录调控因子在膀胱癌细胞系中的生物学功能,明确其作用靶点及其对膀胱癌患者生存的影响。方法1)通过实时定量荧光PCR分析膀胱癌细胞系和正常尿路移行上皮细胞系中miR-34a-5p的表达量,原位杂交法检测有随访信息的膀胱癌组织芯片中miR-34a-5p的相对表达丰度。BSP测序分析miR-34a-5p启动子区的DNA甲基化情况。在线生物信息学分析可能与miR-34a-5p转录起始位点附近结合的转录因子,通过敲低和过表达实验等方法验证所选转录因子与miR-34a-5p的共表达关系,通过染色质免疫共沉淀定位转录因子在miR-34a-5p转录起始位点附近的结合位点。2)在膀胱癌细胞系中稳定过表达miR-34a-5p,通过CCK-8、克隆形成、流式细胞周期检测探索miR-34a-5p对膀耽癌细胞系生物学功能影响。通过western blot筛选文献中已证实的相关功能的靶点,利用荧光素双报告验证miR-34a-5p与该靶点的直接结合。进一步通过敲低过表达等实验探寻调控miR-34a-5p的转录因子对膀胱癌生物学功能的影响及可能的机制,并在小鼠肿瘤模型中验证miR-34a-5p在膀脱癌中的调控机制。结果1)4个膀胱癌细胞系中的miR-34a-5p表达量较正常尿路移行上皮细胞系明显降低(p0.05)。miR-34a-5p在膀胱癌组织中的表达量总体低于癌旁正常组织(p0.0001),且低表达miR-34a-5p与较低的总生存相关(p0.05)。利用在线CpG岛预测网站发现miR-34a-5p转录起始位点上游2000bp以内有三个的CpG岛,利用BSP测序法检测3个CpG岛的甲基化水平,发现在UM-UC-3中,3个CpG岛都表现出高度的DNA甲基化,在T24中,2个远离转录起始位点的CpG岛甲基化水平较高,而离转录起始位点近的1个CpG岛甲基化水平较低,只有在接近miR-34a-5p转录起始位点附近的6-9位的CpG位点存在一致的高甲基化。2)在线生物信息学网址预测到数个可能与miR-34a-5p转录起始位点附近结合的转录因子。检测几种转录因子和miR-34a-5p在4个膀胱癌细胞系中的表达量,发现CTCF与miR-34a-5p的表达呈明显的负相关。敲低过表达实验验证了 CTCF与miR-34a-5p及其母基因的表达负相关性。利用染色质免疫共沉淀实验定位CTCF的结合位点在miR-34a-5p转录起始位点下游500-700bp左右的位置。利用小分子抑制剂及ChIP/Re-ChIP实验证实HDAC1也与CTCF结合在同一位点共同调控miR-34a-5p表达。另外,我们还发现敲低CTCF后,接近miR-34a-5p转录起始位点的CpG岛甲基化水平降低。3)miR-34a-5p过表达、敲低CTCF和HDAC1抑制剂皆能通过G1期阻滞抑制膀胱癌细胞增殖,通过过表达和抑制体实验、以及双报告实验证实miR-34a-5p在膀胱癌中直接靶向抑制CDK6的表达。敲低CDK6实验及敲低后回复实验证实CDK6是膀胱癌G1期过渡的重要蛋白。4)p15和p16是抑制CDK6活性的主要因子。经过敲低和过表达CTCF实验以及染色质免疫共沉淀实验,我们证实p15和p16表达受CTCF的转录抑制。然而单独敲低CTCF并未影响CDK6的表达量,但HDAC1抑制剂与敲低CTCF联合治疗后,CDK6表达降低;再利用针对miR-34a-5p母基因转录本的siRNA干扰上述过程,证实HDAC1抑制剂与敲低CTCF联合治疗所导致的CDK6表达降低至少部分是由于其转录激活miR-34a-5p所致。裸鼠移植瘤模型中证实,与对照组相比,shCTCF+HDAC1抑制剂组肿瘤体积较小,而miR-34a-5p表达量升高,CDK6表达量减少。5)通过检索在线生存曲线分析网址发现,高表达和低表达CTCF的膀胱癌患者生存曲线无显著统计学差异(P=0.197),高表达CDK6的生存期显著低于低表达组(P=0.048),高表达CDK6的平均相对生存期是0.82,而低表达组是0.95。结论1)miR-34a-5p在膀胱癌细胞系中低表达,而"CTCF/HDAC1-DNA甲基化"形成的复合因素共同转录抑制miR-34a-5p的表达。2)miR-34a-5p通过直接靶向CDK6,使膀胱癌细胞发生G1期阻滞,进而抑制其增殖。3)敲低CTCF和HDAC1抑制剂皆能通过G1期阻滞抑制膀胱癌细胞增殖。CTCF又能转录抑制p15/p16表达,而p15和p16是抑制CDK6活性的主要因子。HDAC1抑制剂与敲低CTCF联合治疗能使CDK6表达降低,而且这种作用至少部分是由于其转录激活miR-34a-5p所致。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.14

【参考文献】

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本文编号：1289678