脯氨酰羟化酶3对糖尿病性心肌病的影响及机制研究

发布时间：2017-12-15 00:11

  本文关键词：脯氨酰羟化酶3对糖尿病性心肌病的影响及机制研究

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【摘要】：研究背景糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是发生于糖尿病(diabetes mellitus, DM)人群中,独立于冠心病,高血压和心脏瓣膜病之外的心脏疾病。糖尿病性心肌病是糖尿病最主要的致死原因之一。糖尿病性心肌病早期表现为心肌细胞肥大和舒张功能不全,晚期主要表现为收缩功能不全,易并发充血性心力衰竭,甚至猝死。心肌细胞凋亡和心肌间质纤维化是糖尿病性心肌病的主要病理特征,也是导致糖尿病性心肌病心功能损害的重要病理因素。脯氨酰羟化酶3(prolyl hydroxylase 3, PHD3)是脯氨酰羟化酶家族成员之一。PHD3在缺氧时表达增加,并使缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)发生羟基化而降解,维持体内HIF-1α的动态平衡。除缺氧外,许多其他细胞内因子也能调节PHD3的表达,如在人内皮细胞中,干扰素γ刺激PHD3表达增加；在核髓质细胞中,肿瘤坏死因子α和白介素1β上调PHD3的表达。除了作为一种氧传感器发挥作用外,PHD3还可不依赖于HIF-1α,在细胞凋亡、炎症反应、组织纤维化等方面也发挥重要作用。PHD3主要定位于心肌细胞,在多种心血管疾病如心肌梗死、心肌缺血/再灌注损伤、充血性心力衰竭等心肌组织内均可检测到PHD3蛋白表达上调。有研究发现,在糖尿病合并心肌梗死大鼠模型中,辛伐他丁可通过抑制PHD3发挥心肌保护作用。然而,PHD3在糖尿病性心肌病中具体的作用及机制尚未有人研究。本实验利用高脂喂养和链脲佐菌素(STZ)腹腔注射诱导大鼠糖尿病性心肌病模型,探讨PHD3在糖尿病性心肌病中的作用及其机制。研究目的1.研究心肌组织中PHD3对糖尿病性心肌病大鼠心脏重构和心功能损伤的影响。2.研究心肌组织中PHD3对糖尿病性心肌病大鼠心肌细胞凋亡和心肌间质纤维化的影响。研究方法1.大鼠糖尿病性心肌病模型的建立60只雄性Sprague-Dawley大鼠(100-120 g)随机分为四组(每组n=15)：control组；糖尿病组(DM组)；糖尿病+PHD3-shRNA'慢病毒转染组(DM+shPHD3 组);糖尿病+慢病毒空载体转染组(DM+shN.C组)。Control组给予正常饮食,其余3组给予高脂饮食。4周后,所有大鼠行腹腔葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)和腹腔胰岛素耐量试验(intraperitoneal insulin tolerance test, IPITT)成功诱导胰岛素抵抗的大鼠腹腔注射35mg/kg的链脲菌素(streptozotocin, STZ)。STZ注射1周后检测空腹血糖,随机两次空腹血糖≥11.1mmol/L认为2型糖尿病造模成功。成功诱导2型糖尿病的大鼠继续给予高脂饮食喂养,至STZ注射后第8周行大鼠心功能检测,若出现左室舒张功能障碍则提示糖尿病大鼠开始向糖尿病性心肌病进展,此时可对其进行PHD3慢病毒及空载体慢病毒体内干预。2.PHD3-shRNA'慢病毒载体构建及转染设计3对针对大鼠PHD3基因的shRNA质粒,筛选后选择沉默效率最高的序列构建含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的慢病毒载体。PHD3的干扰序列为5′-GGGCAAATACTATGTCAAG-3',空载体序列为5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。STZ注射8周后,颈静脉注射PHD3-shRNA'漫病毒和空载体慢病毒,4周后取材,制备冰冻切片检测病毒转染效率。3.超声心动图检测大鼠左室功能采用二维、M超、脉冲和组织多普勒技术评价大鼠左室功能。4.组织学染色心脏取材后称重,测量心脏大小,留取心脏大体照片。甲醛固定后,在左室乳头肌水平横切并制备石蜡切片,应用苏木精-伊红(hematoxylin-eosinstaining,HE)染色、Masson染色、天狼猩红染色检测心脏的大体形态结构和心肌胶原含量。应用免疫组化染色检测心肌组织PHD3、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ的分布和表达情况。5. Tunel检测应用Tunel检测大鼠心肌组织中细胞凋亡的情况。6.明胶酶谱应用明胶酶谱法检测心肌组织MMP-2和MMP-9的活性。7.蛋白印迹分析提取大鼠心肌组织蛋白,检测PHD3、cleaved caspase-3、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、 MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平。8.统计学分析各组实验至少独立重复三遍。应用SPSS 18.0软件分析处理数据,以均数±标准差(Mean±SD)表示。p0.05认为有统计学意义。研究结果1.高脂饮食4周成功诱导大鼠胰岛素抵抗大鼠正常和高脂饮食4周后行IPGTT和IPITT检测。结果显示,与对照组大鼠相比,高脂饮食喂养的大鼠在0 min、15min、30min、60min、120 min时血糖值显著升高,血糖曲线下面积(the area under the curve, AUC)显著增加。2.PHD3在糖尿病大鼠心肌组织中表达增高与对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠心肌组织PHD3的蛋白表达水平显著增加。与糖尿病组大鼠相比,PHD3-shRNA'慢病毒转染组大鼠PHD3蛋白水平明显降低,基因干预可以有效抑制心肌组织PHD3的表达。3.PHD3基因沉默改善糖尿病引起的左室重构与正常组大鼠相比,糖尿病大鼠心脏明显增大,心身比值明显增加；左室乳头肌切面HE染色显示,糖尿病大鼠左室呈向心性肥厚；心肌横切面HE染色显示心肌细胞直径显著增加。抑制PHD3可明显改善糖尿病引起的上述心脏结构和形态的变化。4.PHD3基因沉默改善糖尿病引起的心功能损害与正常组大鼠相比,糖尿病组大鼠心功能损害主要表现为舒张功能异常同时伴有收缩功能下降,表现为E/A、E'/A'、LVEF、FS值降低,LVEDd值增加。PHD3基因沉默显著改善上述心功能异常。5.抑制PHD3明显改善糖尿病大鼠的心肌凋亡程度Tunel染色显示糖尿病大鼠心肌细胞的凋亡程度较正常大鼠明显增加。Western blot检测显示心肌组织cleaved caspase-3的表达水平显著增高。抑制PHD3明显降低糖尿病大鼠心肌细胞的凋亡程度和cleaved capase-3的蛋白表达水平。6.抑制PHD3明显改善糖尿病大鼠的心肌纤维化程度Masson和天狼猩红染色显示,与正常大鼠相比,糖尿病大鼠心肌间质胶原沉积明显增加。免疫组织化学和western blot检测显示心肌组织胶原Ⅰ、胶原Ⅲ表达水平显著增高。抑制PHD3显著降低心肌间质胶原沉积和胶原Ⅰ、胶原Ⅲ的表达水平。7.抑制PHD3减少心肌组织MMP2、MMP-9的表达与正常大鼠相比,糖尿病大鼠心肌细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显增高。抑制PHD3后MMP-2、MMP-9蛋白表达水平降低。明胶酶谱检测显示糖尿病大鼠心肌细胞MMP-2活性增加,抑制PHD3后活性降低。研究结论1.PHD3在糖尿病大鼠心肌组织中表达增加；2.应用PHD3-shRNA慢病毒体内干预后,心肌组织PHD3的蛋白表达水平被有效抑制；3.抑制心肌组织PHD3的表达可改善糖尿病大鼠的心脏重构和心功能损害；4.抑制PHD3后糖尿病大鼠心功能损害的减轻主要与其降低心肌凋亡和纤维化有关。研究背景近年来,糖尿病(diabetes mellitus, DM)患病率急剧上升,严重威胁人类健康。持续的高糖血症可导致肾脏、心脏、眼、神经等多种器官功能的损害,其中心血管并发症是糖尿病患者最主要的死亡原因之一。糖尿病患者出现心脏重构和心功能损害,排除冠心病、高血压、心脏瓣膜病等其他可以影响心肌的疾病,称为糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)。心肌细胞凋亡是糖尿病性心肌病心脏重构和心功能损害的重要病理生理机制。动物模型研究发现,心肌细胞凋亡贯穿于整个糖尿病性心肌病病程中,并有逐渐加重的趋势。心肌细胞数量丢失可诱导心肌细胞代偿性肥大,表现为心肌肥厚,出现舒张功能障碍。随着心肌凋亡程度的加重,心肌组织逐渐转为失代偿状态,表现为心脏收缩功能受损,易并发心力衰竭、心律失常甚至猝死。高糖血症可损伤细胞线粒体,使细胞色素C和活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成增多,通过细胞内线粒体途径诱导心肌细胞凋亡。然而,糖尿病诱导心肌细胞凋亡的机制尚未完全明确。脯氨酰羟化酶3(prolyl hydroxylase 3, PHD3)是脯氨酰羟化酶(PHD)家族成员之一。在缺氧状态下反应性增加,调节缺氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)的表达。然而缺氧并不是刺激PHD3表达增加的唯一因素,研究发现,在常氧状态下,多种细胞因子如干扰素γ (interferon-gamma, IFNγ)、肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α, TNFα)、白介素1β (interleukin 1β, IL-1β)也可上调PHD3的蛋白表达水平。我们的前期研究发现,糖尿病心肌组织PHD3的蛋白表达水平显著增加,但糖尿病诱导PHD3高表达的机制尚不清楚。在心肌细胞、人脐静脉内皮细胞等多种细胞中,高糖刺激均可使细胞ROS生成增多,并参与高糖诱导的细胞凋亡过程。研究发现,在缺氧条件下,ROS可与脯氨酰羟化酶相互作用,调节脯氨酰羟化酶的活性。ROS调节PHD3活性的作用具有浓度依赖性,低水平的ROS使PHD的活性增强,高水平的ROS则抑制PHD的活性。在高糖状态下ROS是否介导了PHD3的表达尚未有人研究。我们的前期研究表明,PHD3在糖尿病性心肌病中能促进心肌细胞凋亡,但其具体分子机制尚未探讨。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路可在高糖和糖尿病状态下激活,并促进细胞凋亡、纤维化、炎症等多种反应。在糖尿病性心肌病中,PHD3的促凋亡作用是否与MAPK相关尚待研讨。综上所述,本实验应用高糖刺激H9c2心肌细胞和原代心肌细胞模拟糖尿病状态下体内的高糖血症内环境,探讨高糖诱导心肌细胞PHD3表达上调的机制及PHD3在高糖诱导的心肌细胞凋亡中的作用及机制。研究目的1.研究高糖诱导心肌细胞PHD3表达增加的机制。2.研究PHD3对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响。3.探讨PHD3介导高糖环境下心肌细胞凋亡的信号分子机制。研究方法1.细胞的获取(1)大鼠H9c2心肌细胞系：购自美国American Type Cell Collection公司。(2)原代心肌细胞：由2-3天的大乳鼠左室组织提取。2.细胞培养本实验应用高糖(33.3mM)培养基刺激心肌细胞6 h、12 h、 24 h、48 h,使用正常糖浓度(5.5 mM)的培养基培养心肌细胞作为对照。3.PHD3表达的干预设计3对针对PHD3基因的siRNA表达载体,经筛选后选择沉默效率最高的PHD3-siRNA抑制H9c2心肌细胞PHD3的基因表达。4.激光共聚焦显微镜应用免疫荧光染色法检测H9c2心肌细胞内PHD3的含量和分布。5.ROS的检测使用DCFH-DA探针检测高糖诱导H9c2心肌细胞生成ROS的荧光强度,以及应用细胞ROS清除剂NAC后ROS的荧光强度。6. Tunel检测凋亡检测各组H9c2心肌细胞的细胞凋亡程度,计算细胞凋亡率。7.蛋白印迹提取各组细胞蛋白,检测PHD3、cleaved caspase-3、HIF-1α、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38的蛋白水平。8.统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理数据,并以均数±标准差表示,p0.05认为有统计学差异。研究结果1.在H9c2心肌细胞系和原代心肌细胞中,高糖均诱导PHD3表达增加。应用高糖培养基培养H9c2细胞和原代心肌细胞6h,12 h,24 h,48 h, PHD3的蛋白表达水平逐渐增加,具有时间依赖性。免疫荧光检测显示,PHD3大量定位于胞浆,少量定位于胞核。2.ROS介导高糖诱导的PHD3表达上调。高糖刺激H9c2细胞6 h,12 h,24 h,48 h, ROS的生成增加,具有时间依赖性。应用细胞ROS清除剂NAC后,ROS的表达明显减少,同时PHD3的蛋白表达水平显著降低。3.抑制PHD3减少高糖引起的心肌细胞凋亡。应用PHD3-siRNA转染H9c2细胞抑制PHD3表达,检测PHD3对细胞凋亡的影响。Western blot及Tunel检测结果显示,高糖能增加H9c2细胞凋亡,而抑制PHD3可降低高糖诱导增加的cleaved caspase-3水平及细胞凋亡率。4.在高糖环境下,PHD3的作用与HIF-1α无关应用高糖刺激原代心肌细胞6h,12 h,24 h,48 h, HIF-la的表达水平无明显变化,应用PHD3 siRNA抑制H9c2细胞PHD3的表达后,HIF-1α的表达仍未有改变。5.抑制PHD3降低高糖诱导的心肌细胞MAPK磷酸化水平。Western blot检测H9c2细胞中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38及p38水平,结果显示抑制PHD3能够显著降低高糖诱导的ERK及JNK的磷酸化水平的上调,而对p38的磷酸化水平无影响。研究结论1.ROS介导了高糖诱导的心肌细胞PHD3表达上调。2.抑制PHD3减少高糖引起的心肌细胞凋亡。3.抑制PHD3减少心肌细胞凋亡的作用是通过阻断MAPKs信号通路实现的。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R542.2

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本文编号：1289890