益气活血方基于Notch信号调控心肌梗死后心肌重构作用机理的研究

发布时间：2017-12-15 10:00

  本文关键词：益气活血方基于Notch信号调控心肌梗死后心肌重构作用机理的研究

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【摘要】：背景与目的:心血管疾病已成为我国的重大公共卫生问题,其中急性心肌梗死的发病率和死亡率呈快速上升态势,经皮冠状动脉介入治疗术(percutaneous coronary intervention,PCI)是急性心肌梗死的重要治疗方法,可以有效降低死亡率和再发梗死率,但是队列研究显示单纯接受PCI患者的预后获益并不优于强化药物治疗的患者,且PCI不仅带来了冠脉微循环障碍,也带来了不同程度的心肌重构,这就提醒我们需要更加关注冠脉微循环障碍与心肌重构,努力拨慢心肌梗死后心力衰竭进展的时钟,改善患者的预后。线粒体损伤是心肌重构发生与进展的关键因素,线粒体能量代谢障碍、结构功能破坏是多种线粒体损伤形式的始动环节。因此关注线粒体损伤,关注线粒体能量代谢、线粒体结构与功能,改善心肌缺血和防治心肌重构,对于预防与改善心肌梗死后心力衰竭发生发展的病理基础有重要意义。Notch及AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路可以从多角度对线粒体能量代谢进行调控,保护线粒体结构和功能,有望成为临床药物研究与开发的新靶点。依据中医气血理论创立的益气活血方是临床常用治疗心肌缺血的经验方,具有益气养心,活血通脉的功效。前期研究显示本方可以有效减轻心肌梗死患者的临床症状、增强心脏收缩功能,改善冠脉微循环障碍。因此,本研究将从调节线粒体能量代谢、保护线粒体结构和功能的角度,以Notch及AMPK信号通路为桥梁,观察益气活血方防治心肌重构的作用机制。方法:结扎大鼠冠状动脉左前降支复制心肌梗死动物模型,术后第2天予以相关药物干预,观察7天、28天两个时间节点相关指标变化情况。本研究分为四个实验:实验一、二、三随机将造模成功大鼠分为心肌梗死组、益气活血方组、培哚普利组、DAPT(γ分泌酶抑制剂,Notch信号抑制剂)组、Notch抑制剂+益气活血方组,并设置假手术组。运用超声心动观察各时间节点大鼠心脏结构和功能变化,运用HE染色观察心肌细胞形态学变化,以评价各组大鼠成模情况及左心室重塑程度。通过蛋白印迹法及实时荧光定量法分别检测Notch,AMPK信号通路相关蛋白及mRNA表达,观察Notch及AMPK信号通路交叉对话关系,揭示该交叉对话在心肌梗死后心肌重构中的作用。运用ELISA检测大鼠血糖及游离脂肪酸变化,运用蛋白印迹法检测葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)及乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白表达,揭示益气活血方提高Notch1和AMPK交叉对话,通过不同作用机制动态调节心肌梗死大鼠糖脂代谢,改善线粒体能量障碍。实验四将造模成功大鼠随机分为心肌梗死组、益气活血方组、培哚普利组,并设置假手术组。运用透射电镜观察线粒体形态结构变化;采用蛋白质印迹法检测过氧化物酶增殖激活受体Y辅助激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)、线粒体转录因子A(mtTFA)蛋白表达变化;运用荧光酶标法检测ATP合成情况,揭示益气活血方保护线粒体结构和功能,从而促进ATP合成,以发挥心肌保护作用。结果:(1)心脏结构和功能:心肌梗死组大鼠心脏左室射血分数(LVEF)、左室短轴率(LVFS)明显下降,左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期容积(ESV)、左室舒张末期容积(EDV)明显增加(Pall0.01)。7天时,与心肌梗死组大鼠相比,益气活血方组和培哚普利组LVEF、LVFS升高(Pall0.05),LVIDs、LVIDd、EDV、ESV缩减,但无明显统计学差异(Pall0.05),Notch抑制剂组LVEF明显下降(P0.01),LVFS率下降,LVIDs、LVIDd、EDV、ESV增加,但无明显统计学差异(P0.05)。与益气活血方组相比,Notch抑制剂+益气活血方组LVEF、LVFS下降(Pall0.05),LVIDs缩减、LVIDd、EDV、ESV增加,但无明显统计学差异(Pall0.05)。28天时,与心肌梗死组大鼠相比,益气活血方组LVEF、LVFS升高、EDV、ESV缩减(Pall0.05),培哚普利组LVEF、LVFS升高,EDV、ESV缩减,但无明显统计学意义(Pall0.05),益气活血方组与培哚普利组LVIDs、LVIDd缩减(Pall0.01),Notch抑制剂组LVEF、LVFS明显下降,LVIDs、LVIDd、EDV增加(p0.05),ESV增加,但无明显统计学差异(P0.05)。与益气活血方组相比,Notch抑制剂+益气活血方组LVEF、LVFS降低,LVIDs、LVIDd、ESV增加(Pall0.01),EDV增加,但无明显统计学差异(P0.05)。结果表明,心肌梗死后,心脏收缩功能下降,心室重塑明显,运用益气活血方可以改善心脏收缩功能,减轻心室重塑程度。(2)心肌细胞形态学:假手术组大鼠心肌细胞排列整齐,纹理清晰,偶有断裂,心肌纤维结构清楚,未见明显炎性细胞浸润;7天时,心肌梗死组大鼠心肌细胞排列紊乱，，纹理走向不确定,可见灶性心肌纤维走形中断,心肌细胞核溶解、消失,大量炎性细胞浸润。28天时,心肌梗死组大鼠心肌细胞排列紊乱,纹理走向不确定,可见大量灶性心肌纤维走形中断,大量纤维及胶原组织增生。益气活血方组和培哚普利组大鼠心肌细胞增生明显,重新排列较规整,部分纤维及胶原组织增生,较心肌梗死组病变范围减小。Notch抑制剂组心肌细胞排列紊乱,纹理走向不确定,可见大量灶性心肌纤维走形中断,纤维及胶原组织增生较心肌梗死组扩大,Notch抑制剂+益气活血方组病理改变与Notch抑制剂组相似,但纤维及胶原组织增生较其减轻。表明心肌梗死后,心肌细胞形态破坏明显,运用益气活血方可以有效减轻心肌细胞形态破坏。(3)Notch和AMPK信号通路交叉对话:7天时,与假手术组相比,心肌梗死组Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表达下降(Pall0.01)。与心肌梗死组相比,益气活血方组和培哚普利组 Notch、pLKB1、pAMPK 蛋白表达升高(Pall0.05),Notch 抑制剂组 Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表达下降(Pall0.05)。与益气活血方组相比,Notch抑制剂+益气活血方组Notch、pAMPK蛋白表达下降(Pall0.01),pLKB1蛋白表达呈下降趋势(P=0.056)。28天时,与假手术组相比,心肌梗死组Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表达下降(Pall0.01)。与心肌梗死组相比,益气活血方组和培哚普利组Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表达升高(Pall0.01),Notch 抑制剂组 Notch、pLKB1、pAMPK 蛋白表达下降(Pall0.05)。与益气活血方组相比,Notch抑制剂+益气活血方组Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表达下降(Pall0.01),表明Notch与AMPK信号通路间存在交叉对话,心肌梗死后,Notch和AMPK信号蛋白表达下降,运用益气活血方可以增加Notch和AMPK信号蛋白表达。(4)心肌细胞能量代谢:7天时,与假手术组大鼠相比,心肌梗死组大鼠血糖、游离脂肪酸升高(Pall0.05)。与心肌梗死组大鼠相比,益气活血方组与培哚普利组血糖、游离脂肪酸下降(Pall0.01),Notch抑制剂组血糖、游离脂肪酸升高,但无明显统计意义(Pall0.05)。与益气活血方组相比,Notch抑制剂+益气活血方组血糖、游离脂肪酸升高(Pall0.05)。28天时,与假手术组大鼠相比,心肌梗死组大鼠血糖、游离脂肪酸升高(Pall0.01)。与心肌梗死组大鼠相比,益气活血方组血糖、游离脂肪酸降低(Pall0.05),培哚普利组血糖降低,但无明显统计学差异(P=0.252),游离脂肪酸降低明显(P0.01),Notch抑制剂组血糖、游离脂肪酸升高(Pall0.05)。Notch抑制剂+益气活血方组血糖、游离脂肪酸升高(Pall0.01)。7天时,与假手术组相比,心肌梗死组GLUT4,pACC蛋白表达下降(Pall0.05)。与心肌梗死组相比,益气活血方组与培哚普利组GLUT4蛋白表达呈升高趋势,但无明显统计学差异.(Pall0.05),pACC蛋白表达升高(Pall0.05),Notch抑制剂组GLUT4蛋白表达呈降低趋势,但无明显统计学差异(P0.05),pACC蛋白表达降低(P=0.004)。与益气活血方组相比,Notch抑制剂+益气活血方组GLUT4蛋白表达呈降低趋势,但无明显统计学差异(P0.05),pACC蛋白表达降低(P=0.027)。28天时,与假手术组相比,心肌梗死组GLUT4,pACC蛋白表达下降(Pall0.05)。与心肌梗死组相比,益气活血方组与培哚普利组GLUT4蛋白表达升高(Pall0.05),pACC蛋白表达呈升高趋势,但无明显统计学差异(Pall0.05),Notch抑制剂组GLUT4蛋白表达降低(P=0.034),pACC蛋白表达呈降低趋势,但无明显统计学差异(P0.05)。与益气活血方组相比,Notch抑制剂+益气活血方组GLUT4蛋白表达降低(P=0.047),pACC蛋白表达呈降低趋势,但无明显统计学差异(P0.05)。各组ACC蛋白表达无统计学差异。表明心肌梗死后,糖脂代谢紊乱,益气活血方可以调节糖脂代谢,改善线粒体能量代谢障碍。(5)线粒体结构、功能与ATP合成:假手术组心肌纤维排列整齐且紧密,横纹清晰可见,肌小节完整,线粒体形态正常,膜完整,嵴清晰;7天时,心肌梗死组心肌细胞肌丝排列严重紊乱肌纤维走形不规则、断裂,可见肌原纤维溶解消失,线粒体形态大小不等,部分空泡化明显,界膜破裂,嵴模糊不清,嵴间基质密度增高。28天时,心肌梗死组心肌细胞肌丝排列严重紊乱,肌纤维走形不规则、断裂,可见胶原纤维及组织增殖,肌丝断裂处可见线粒体聚集,形态大小不等,嵴模糊不清,嵴间基质密度增高。7天时,与假手术组相比,心肌梗死组大鼠PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白表达量显著减少,具有统计学意义(Pall0.05)。与心肌梗死组相比,益气活血方组与培哚普利组PGC-1 α、NRF1、mtTFA蛋白表达呈增多(Pall0.05),差异具有统计学意义。28天时,与假手术组相比,心肌梗死组大鼠PGC-1α蛋白表达呈下降趋势(P=0.111),NRF1、mtTFA表达量显著减少,具有统计学意义(Pall0.01)。与心肌梗死组相比,益气活血方组与培哚普利组PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白表达呈增多,差异具有统计学意义(Pall0.05)。表明心肌梗死后,线粒体结构破坏,线粒体生物合成功能下降,益气活血方可以改善线粒体结构,并通过AMPK信号通路促进了心肌线粒体的生物合成。结论:1.益气活血方可有效改善心肌梗死大鼠心脏收缩功能,减轻心室重塑程度;2.益气活血方能够调节心肌梗死后糖脂代谢,改善心肌细胞线粒体能量代谢障碍,其作用可能与提高Notch信号通路与AMPK信号通路交叉对话的调控有关;3.益气活血方可以保护线粒体结构和功能,促进ATP合成,发挥心肌保护作用。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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本文编号：1291515