巨噬细胞调控心梗后交感神经再生的作用和分子机制

发布时间：2017-12-15 10:01

  本文关键词：巨噬细胞调控心梗后交感神经再生的作用和分子机制

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【摘要】：研究背景心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)是MI的常见并发症,每年每10万人中平均有0.46-3.7人死于SCD。在临床实践中,在MI早期,患者易反复发作室速(VT)、室颤(VF),亦称为"交感电风暴",其发生与交感神经过度增生和激活密切相关,尽管抗心律失常药物胺碘酮、ICD植入术和射频消融术在MI后电风暴中广泛应用,仍存在心律失常反复、不能终止的现象。在犬类及啮齿类动物实验中,针对交感神经的左侧星状神经节阻滞、肾交感神经切除术及迷走神经刺激术在改善MI后室性心律失常发作中效果显著,但临床样本少、缺乏有力证据。目前,交感神经过度增生为特点的心脏自主神经重构成为MI早期VT、VF发作的重要元素,所以,探讨MI后交感神经过度增生的分子机制可为临床MI后恶性心律失常的防治提供新的理论依据和治疗靶点。研究发现,炎症反应在外周神经损伤和再生中起到重要作用。这一发现为自主神经重构的防治打开了新的视窗。炎症介导的心肌梗死(MI)周边交感神经增生与心律失常致心源性猝死的发病紧密相关,有研究表明,MI处浸润的巨噬细胞通过产生神经生长因子(NGF)成为连接炎症反应和交感神经再生的纽带,但具体的调控机制尚不明确。巨噬细胞调控NGF的机制尚不明确。巨噬细胞主要分为促炎的M1型和抑炎的M2型。在对于MI后心肌重构的研究中发现,巨噬细胞的表型和功能连续变化。在MI急性炎症期,M1型巨噬细胞大量浸润,并在MI3天达到高峰;5天后,M2型巨噬细胞逐渐增多,并于MI7天达高峰,此后巨噬细胞逐渐消退。进一步探寻MI后调控巨噬细胞的表型和功能的上游分子可为心梗后自主神经重构。Notch信号在MI后炎症细胞中过度激活,同时Xu等在Nature communication中的最新研究发现,Notch可调控巨噬细胞的表型转变,参与巨噬细胞介导的炎症反应调控,但其在MI后交感神经重构中的作用未有报道。因此我们猜测,Notch信号的激活参与MI后巨噬细胞表型转变,这一过程可通过影响NGF的释放参与MI后交感神经重构的调控过程。研究目的我们旨在探究Notch信号在MI后的激活状态,Notch信号对MI后巨噬细胞及其主导的炎症反应影响,最终探讨Notch信号对心脏交感神经再生的影响和机制。研究方法流程一实验大鼠分为以下四组:Ⅰ,假手术+DMSO组:予大鼠冠状动脉前降支穿线不结扎,DMSO尾静脉注射,每次剂量50ul,造模前半小时首次注射,后每天一次直至取材;Ⅱ,假手术+ DAPT 组(N-N-(3,5-difluorophenacetyl-1-alanyl)-S-phenylglycine-t-butyl ester):手术及DAPT注射方法同组Ⅰ,DAPT单次剂量10mg/kg,溶于50ulDMSO中;Ⅲ,MI+DAPT组:予大鼠冠状动脉结扎诱发MI,DAPT注射及频次同前,注射方法同组Ⅱ;Ⅳ,MI+DMSO组:MI造模及DMSO注射方法同组Ⅲ。MI后三天,分离心肌梗死区巨噬细胞,梗死区心肌,梗死灶周心肌,梗死远端心肌及空白心肌行RT-PCR检测Notch信号通路相关蛋白(NICD1、Hes1)的mRNA表达;同时采用免疫荧光和Western blot分别定位和定量梗死心脏NICD1的表达,同时行CD68、CD163及CD68、Arg1荧光双染及RT-PCR判定巨噬细胞表型;Elisa检测血浆中TNF-α,IL-1β的水平。MI后7天,利用心室压力容积系统测定血流动力学状态;程序性电刺激测定心律失常易感性;采用酪氨酸羟化酶(TH)、生长相关蛋白43(GAP43)荧光染色半定量分析心脏交感神经再生。流程二为分析DAPT对NGF的作用,我们将MI大鼠分为:Ⅰ,MI组:方法同上;Ⅱ,MI+DAPT 低剂量组(5mg/kg);Ⅲ,MI+DAPT 高剂量组(1Omg/kg),7天后取材,RT-PCR和Western Blot测定梗死区和梗死灶周NGF的mRNA和蛋白水平;利用CD68和NGF荧光双染判定表达NGF的巨噬细胞比例。流程三体外实验:提取大鼠骨髓巨噬细胞,在加入NGF的培养基中培养3天,后随机分为:空白组、LPS(10μg/ml)+IFN-γ(20ng/ml)组、LPS(10μg/ml)+IFN-γ(20 ng/ml)+DAPT(10 μg/ml)组;空白组、IL-4(10 ng/ml)组、IL-4+DAPT组。研究结果1、同巨噬细胞极化的时间窗一致,Notch信号相关蛋白NICD1和Hesl在MI3天显著激活,至MI7天表达回落至与正常水平相当。RT-PCR和免疫荧光双染定量和定位Notch信号的激活。Notch信号在巨噬细胞中显著激活,在梗死心脏中主要与CD68阳性的巨噬细胞共染,而非心肌细胞和成纤维细胞等。2、MI早期应用Notch信号阻断剂DAPT减少梗死区巨噬细胞的募集,降低血浆中TNF-α,IL-1β的水平,同时增加MI早期M2型巨噬细胞的比例,并以剂量依赖型的方式减少NGF的合成;最终,免疫荧光显示,DAPT降低MI7天TH、GAP43阳性的交感神经纤维数目,改善交感神经重构。与此一致,程序性电刺激得到的心律失常评分示,DAPT干预的MI大鼠室性心律失常易感性明显降低。此外,血流动力学检测和Masson染色结果发现,DAPT干预会导致心功能恶化、心梗面积扩大。体外实验发现,LPS/IFN-γ以Notch依赖的方式上调M1型巨噬细胞NGF的表达。3、体外BMM实验指出,抑制Notch信号改变M1型巨噬细胞的极化状态,并以Notch信号依赖的方式减少LPS/IFN-y诱导的M1型巨噬细胞中NGF的产生,相反,其对M2型巨噬细胞的极化状态和NGF的合成无影响。研究结论在大鼠MI模型中,我们证明Notch信号MI的急性炎症期在巨噬细胞中过度激活,并参与MI后巨噬细胞表型转换的调控。抑制Notch信号使巨噬细胞早期向M2型转换,下调NGF的表达,最终改善MI后交感神经过度增生。研究结果提示Notch信号可能是通过巨噬细胞依赖途径,参与MI后交感神经重构,这一发现为心梗后室性心律失常的防治提供了新的靶点。研究背景目前,炎症反应在MI后自主神经重构中的作用已被广泛证实,在动物实验中,多种抗炎药物、及包括NF-kB、PPAR-γ在内的炎症信号的阻断剂均具有改善MI后自主神经重构的作用,但直接将炎症反应和MI后神经再生的"纽带"仍不明确。直至09年,WernliG等人发现巨噬细胞通过大量合成NGF成为联系炎症反应和交感神经增生的重要纽带:他们通过膦酸二钠脂质体药物敲除巨噬细胞发现,MI后浸润在梗死心肌中的分泌神经生长因子(NGF)的主要来源。第-部分实验中,我们通过调控Notch信号调控巨噬细胞表型,发现抑制Notch信号调控巨噬细胞向M2方向转化的同时NGF产生减少,交感神经重构得以改善,间接说明了 M1型巨噬细胞在MI后交感神经中的作用。但或许阻断Notch信号过早的使巨噬细胞向M2方向极化,导致MI 7天心律失常易感性明显改善的同时,心功能显著恶化。明确M1型巨噬细胞—NGF的作用后,我们继续寻找调控M1型巨噬细胞合成NGF的上游分子靶点。M1型巨噬细胞以分泌IL-1β在内的多种炎症细胞为特点。以IL-1β为代表的促炎性细胞因子通过调控神经营养因子的表达在糖尿病外周神经病变、视网膜神经病变等疾病中成为研究热点。有研究指出,组织巨噬细胞IL-1β的成熟与分泌完全依赖于P2X7R信号。在缺氧、细胞损伤及机械应力等刺激下,大量ATP会释放到细胞外基质中,激活P2X7R,改变细胞破坏/损伤处的免疫反应。P2X7R是以三磷酸腺苷(ATP)为配体的非选择性阳离子门控通道(K+、Na+、Ca2+等),主要选择性的表达在造血源性细胞,如单核/巨噬细胞、淋巴细胞等免疫相关细胞中。它在炎症反应中主要通过M1型巨噬细胞IL-1β的产生发挥作用,在M2型巨噬细胞中功能学意义较小,对表型改变不大。我们前期实验表明,巨噬细胞分泌NGF和炎症因子调控MI后交感神经再生。髓系P2X7信号通过激活NOD样受体(NLRP3),介导M1型巨噬细胞IL-1β的切割成熟和分泌。但其在NGF分泌及交感神经再生中的作用未有研究。研究目的我们旨在探讨A-740003,一种P2X7R拮抗剂,是否参与MI后炎性反应和交感神经再生;并探讨NLRP3/IL-1β通路是否参与这一过程。研究方法流程一为了在体研究P2X7R和IL-1β的关系,我们将25只大鼠随机分为4组:Ⅰ,空白(Naive)组;Ⅱ,内毒素(LPS)组:LPS 2 mg/kg稀释到生理盐水中一次性腹腔注射;Ⅲ,LPS+BzATP组:LPS方法剂量同前,注射后3小时,BzATP,P2X7R 激动剂,50μg/5μL;LPS + BzATP + NLRP3 抑制剂组:BzATP和LPS剂量方法同前,NLRP3抑制剂16673-34-0(100 mg/kg稀释在0.05 ml生理盐水中)在LPS注射前30分钟皮下注射。LPS注射后6小时取心脏左室,对 P2X7R、NLRP3、caspase-1、IL-1β 行蛋白定量 Western Blot 检测。流程二为了研究P2X7R和IL-1β在MI后的动态变化,我们将27只MI大鼠按取材时间点随机分为以下6组:MI-0d,MI后立即取材;MI-0.5d,MI后半天取材;MI-1d,MI后1天取材;MI-3d,MI后3天取材;MI-5d,MI后5天取材;MI-7d,MI后7天取材。取不同时间点的梗死心肌行P2X7R,NLRP3和IL-1β的 Western Blot 检测。流程三为了研究P2X7R和IL-1β在MI后交感神经重构中的作用和机制,我们将大鼠随机分为以下几组:Ⅰ,假手术组(n =15);Ⅱ,MI组(n =28):造模方法同第一部分;Ⅲ,MI + A-740003组(n =28):A-740003 50 mg/kg溶解在生理盐水中并于MI前一天腹腔注射,每天一次直至第七天取材;Ⅳ,MI+Anakinra组(n =30):2 mg/kg大鼠重组IL-1R拮抗剂(Anakinra)溶解在0.67ml 0.9%的氯化钠中,术后即刻皮下注射,每天一次直至第七天取材;V,MI +A-740003+Anakinra组(n =28):A-740003、Anakinra剂量、给药方式同前。于MI后3天和7天取材。MI3天取左室梗死灶周区域行Western blot检测P2X7信号相关蛋白P2X7R、NLRP3、caspase-1、IL-1β的表达;MI7天取材前用心室压力容积系统行血流动力学检测,后开胸行程序性电刺激检测大鼠室性心律失常易感性;取梗死灶周组织行CD68抗体的免疫组化检测巨噬细胞的浸润,行梗死灶周CD68和NGF的免疫荧光双染半定量合成NGF的巨噬细胞比例,行Western blot检测梗死灶周NGF总蛋白水平。最后,我们行酪氨酸羟化酶(TH)和生长相关蛋白-43(GAP43)的免疫荧光染色评价MI后交感神经再生程度。研究结果1、在注射LPS大鼠的左室中,Western Blot示LPS可明显增加NLRP3的表达水平,但切割caspase-1和成熟IL-1β的表达并未显著增加;LPS刺激基础上予以P2X7R激动剂BzATP可诱发caspase-1的激活和成熟IL-1β的释放,这一过程被NLRP3抑制剂(16673-34-0)阻断。2、MI模型大鼠的左室中,免疫荧光半定量示P2X7R主要与梗死心肌中浸润的巨噬细胞共染;Western Blot示P2X7-NLRP3炎症体和IL-1β显著激活,P2X7R抑制剂A-740003阻断NLRP3/IL-1β的激活。免疫组化示A-740003和/或Anakinra明显减少巨噬细胞的浸润,并减少NGF阳性的巨噬细胞数目,降低NGF的蛋白水平。TH和GAP43荧光半定量示,A-740003和/或Anakinra阻断交感神经的过度增生。其中,A-740003和A-740003 + Anakinra处理组交感神经增生减少的水平相当,Anakinra处理组对交感神经增生减弱的幅度较前两者略弱,间接提示P2X7信号介导MI交感神经再生的病理过程部分通过IL-1β发挥作用;此外,血流动力学和Masson染色结果提示,阻断P2X7通路可明显改善心功能,降低梗死面积。3、体外实验中,免疫荧光双染示,P2X7R在M1和M2型巨噬细胞中均明显激活。Western blot示BzATP刺激进一步增加M1型巨噬细胞中NGF和IL-1β的表达,这一过程被IL-1β阻断剂Anakinra阻断;相反,在M2型巨噬细胞中,P2X7R的激活不能引起IL-1β和NGF表达的增加。研究结论我们的数据表明P2X7R通过IL-1β增加M1型巨噬细胞中NGF的表达;药物阻断P2X7R可以通过抑制NLRP3/IL-1β通路减轻MI后交感神经再生程度,从而进一步减轻MI后室性心律失常的发生。同时,P2X7R阻断剂改善MI后心功能。这为临床改善MI预后提供了新的治疗靶点和理论依据。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R542.22
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本文编号：1291523