全基因组DNA甲基化参与胃癌发生发展的机制研究

发布时间：2017-12-15 10:22

  本文关键词：全基因组DNA甲基化参与胃癌发生发展的机制研究

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【摘要】：胃癌是严重危害我国居民身心健康的常见消化系统恶性肿瘤之一,由于缺乏早期、特异、敏感的筛查和诊断指标,给胃癌的早期诊断和治疗带来极大的困难和挑战。因此,加强对胃癌病因学、发病机制及预后因素的研究,筛选可靠的可用于预测胃癌发病及预后的生物标志物,对今后胃癌的预防、干预、治疗和预后判断均具有重要的意义。胃癌的发生发展及临床转归是涉及遗传和表观遗传改变所致细胞调节和生长失控的多阶段复杂过程,是环境因素和遗传因素共同作用的结果。大量的流行病学调查数据表明,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)感染、饮食因素(高盐、含N-亚硝基化合物、新鲜蔬菜和水果摄入不足)、吸烟、肥胖、家族遗传史等都与胃癌的发生风险密切相关。各种环境危险因素在不同阶段作用于不同基因,引起表观遗传的改变,继而导致相关基因活性和表达水平的改变,这些基因环境之间的交互作用,最终导致胃癌的发生发展。机体参与环境应答的关键调控之一是基因组调控区域的甲基化,基因启动子区的CpG岛的甲基化在调控基因表达方面发挥重要作用,但是在全基因组水平揭示DNA异常甲基化参与胃癌发生发展的机制的研究目前还很匮乏,而且基因调控区的异常甲基化参与胃癌发生发展的分子机制并没有被完全阐明。此外,位于基因调控区CpG岛的遗传变异(主要是单核苷酸多态性,SNP)是否可以调控表观遗传效应,共同参与胃癌的发生和临床转归还有待进一步研究。本研究拟在全基因组水平探讨表观遗传机制,以及遗传与表观遗传的交互效应参与胃癌发生发展以及预后的分子机制,以期为胃癌的早期预防、病因学研究以及预后判断提供基础研究证据。第一部分高甲基化基因及CCNMA1通过调控PTK2参与胃癌发生发展的机制研究研究背景基因启动子区的甲基化在调控基因表达方面发挥重要作用,由于启动子高甲基化导致的抑癌基因失活,在多种肿瘤发生发展中扮演重要的角色。但是在全基因组水平揭示DNA异常甲基化参与胃癌发生发展机制的研究目前还很匮乏,所以在全基因组水平揭示胃癌发生过程中的甲基化水平差异显得尤为必要和迫切。研究方法本研究收取12位胃癌患者的癌组织及其癌旁正常组织,提取组织DNA,亚硫酸盐修饰后,采用Illumina Human甲基化450K芯片检测胃癌患者癌与癌旁组织全基因组的甲基化水平差异,并采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)和亚硫酸盐测序法(bisulphite sequencing,BSP)的方法进一步验证特异性CpG岛在癌和癌旁的甲基化水平差异,然后通过生物信息学,细胞表型实验,以及动物实验探索目的基因KCNMA1与下游靶基因之间的调控关系,最后使用Kaplan-Meier生存曲线评估KCNMA1启动子高甲基化对于胃癌预后的影响。研究结果系统分析芯片结果发现,位于基因KCNMA1启动子区的CpG位点cg24113782具有最显著的统计学差异(P = 0.006),cg24113782参与调控基因KCNMA1在胃癌组织和胃癌细胞中的表达沉默。进一步在112对组织中验证发现,癌组织中KCAM41基因启动子区发生甲基化的比例为66.7%(77/112),而癌旁中发生甲基化的比例仅为16.2%(18/112),生存分析提示KCNMA1启动子区的高甲基化预示胃癌患者不良的预后结局(P= 0.036)。体外实验表明在胃癌细胞中过表达KCNMA1表达质粒能明显抑制细胞的增殖、侵袭、转移等恶性表型(P0.001),采用流式细胞仪研究发现KCNMA1主要是通过促进肿瘤细胞凋亡,进而调控细胞的恶性表型;裸鼠荷瘤实验也发现,过表达KCNMA1能明显抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的增殖,过表达KCNMA1的瘤体生长速度明显下降(P0.001)。进一步的研究我们发现KCNMA1发挥抑癌效应,主要是通过降低FAK凋亡通路促癌基因PTK2的表达,进而影响胃癌细胞凋亡进程实现的。研究结论本项研究发现胃癌组织中启动子区异常高甲基化基因KCNMA1通过调控PTK2的表达参与胃癌的发生发展,它的启动子区高甲基化是预测胃癌患者预后的独立预测指标。第二部分基于全基因组的DNA甲基化相关SNPs(CpG-SNPs)与胃癌发病风险的关联及其机制研究研究背景大量的研究已经证实位于基因组DNA上的SNPs可以影响其本身或者附近CpG位点的甲基化状态,导致携带不同等位基因的个体,SNPs所在宿主CpG岛甲基化水平的差异。SNPs可能通过改变其所在CpG岛的甲基化状态,干扰转录因子的结合,进而影响下游基因的转录调控,导致肿瘤的发生。因此,在全基因组水平探讨遗传变异与表观遗传的交互效应,能够为揭示胃癌发生风险相关SNPs位点的生物学功能开辟新的研究思路。研究方法本研究结合胃癌全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS)的数据,并通过ENCODE(encyclopedia of DNA elements)数据库,获得全基因组内的所有CpG岛的基因组物理位置,采用Illumina 660W Quad chip对这个区域内的所有SNPs进行基因分型,并采用一系列分子生物学方法,探索显著关联SNPs调控其宿主CpG岛的甲基化水平的分子机制,以及相关基因的分子功能。研究结果:首先对所有CpG岛内的SNPs进行基因分型,并计算其OR值和95%CI,采用Bonferroni校正后,发现位于假基因(pseudogene)GBP1启动子区的遗传变异rs2990245与胃癌的发生风险显著相关,在显性模型中,相对于携带TT基因型的个体,携带CT和CC基因型的个体罹患胃癌的风险减少20%(OR = 0.80,95%CI = 0.68-0.94,P=0.0076);隐性模型的结果也发现相对于携带TT和CT基因型的个体,携带CC基因型者发生胃癌的风险显著降低(OR = 0.40,95%CI= 0.24-0.65,P= 0.0002)。进一步的研究发现rs2990245可以通过影响GBAP1的启动子区的甲基化状态,进而调控GB4P1的表达。双荧光实验表明,rs2990245T等位基因的转录活性明显高于C等位基因。此外,我们发现GBAP1在胃癌中显著高表达,并且其在细胞质中的表达明显高于核内的表达。更进一步的研究结果发现GBAP1可以扮演"内源竞争性RNA"(competing endogenous RNAs,ceRNA)的角色,通过和其同源基因GB4竞争吸附miR-212-3p,解除miR-212-3p对GB4的抑制效应,上调基因GBA的表达。表达相关性分析发现,GBAP1与GBA在胃癌组织中的表达呈现显著的正相关,且其表达相关性也被TCGA和GEO数据所证实。研究结论我们的研究结果表明rs2990245与中国人群的胃癌发病风险显著相关,其可以通过调控GB4P1的启动子区甲基化进而调控GBAP1的表达;GBAP1可以与其同源基因GB4竞争结合miR-212-3p,参与胃癌的发生发展。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

【参考文献】

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本文编号：1291636