多烯磷脂酰胆碱联合奥沙利铂抗胃癌增殖作用的研究

发布时间：2017-12-15 16:15

  本文关键词：多烯磷脂酰胆碱联合奥沙利铂抗胃癌增殖作用的研究

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【摘要】：胃癌在我国发病率较高,严重危害着人民的生命健康。化疗在胃癌的综合治疗中占有很重要的地位,因此化疗的有效率是影响胃癌患者预后的重要因素之一。奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)为铂络合物类抗癌药物第三代衍生物,与顺铂无明显交叉耐药,广泛用于治疗胃肠道等消化系统来源的肿瘤,其作用机制为通过与DNA产生烷化络合作用,进而形成细胞内DNA链内和链间的交联,抑制恶性肿瘤细胞内的DNA合成和复制。奥沙利铂目前广泛应用于胃癌的术后辅助治疗及晚期胃癌的多线化疗,随着临床使用经验的积累,发现奥沙利铂导致的肝脏毒性也较为常见。由于目前有关奥沙利铂诱发的肝脏功能损伤机制尚不十分明确,临床工作中对于以奥沙利铂为基础的化疗是否常规使用护肝药物或使用何种保肝药物尚无定论多烯磷脂酰胆碱(Polyennephosphatidylcholine,PPC)是必需磷脂的主要活性成分之一,对细胞和亚细胞膜具有高效生物利用度和高度亲和力,能够以整个完整的分子与细胞膜或细胞器膜相结合,增加膜的稳定性、流动性和完整性,同时可以减少细胞的氧应激与脂质过氧化、降低细胞炎症反应和抑制细胞凋亡等各项作用。对于肝脏组织,可以通过增加肝胶原降解,阻止肝细胞中各组因素所致的线粒体异常,减轻肝纤维化。目前多烯磷脂酰胆碱是临床中较为常用的一种保肝药物,同时也是一种围化疗期处理化疗性肝损伤的常用药物。但是有关多烯磷脂酰胆碱对于奥沙利铂抗肿瘤疗效的影响,目前尚不清楚。目前含奥沙利铂的化疗方案已经广泛应用于临床胃癌的治疗中。尽管各种抗癌治疗的发展取得了长足进步,但是胃癌治疗中奥沙利铂耐药性日趋明显,无论原发性耐药或者继发性耐药,且成为抗肿瘤治疗的主要瓶颈。探讨奥沙利铂耐药机制已成为目前胃癌治疗的关键问题之一。有关奥沙利铂在胃癌细胞耐药机制十分复杂,目前尚不十分明确,涉及与肿瘤生长的相关的微环境,细胞线粒体、细胞膜以及细胞蛋白质和信号传导等多种因素,目前,已经有许多研究对这一现象及其机制进行了探讨。目前较为热门主要集中在耐药相关的ABC超家族蛋白以及肿瘤干细胞。对上述问题,本课题拟通过两部分内容开展:首先探讨多烯磷脂酰胆碱对奥沙利铂化疗疗效的影响,结果提示低浓度多烯磷脂酰胆碱可以与奥沙利铂可产生协同抗肿瘤作用。在发现多烯磷脂酰胆碱可以与奥沙利铂可产生协同抗肿瘤疗效后,开展第二部分研究,诱导胃癌奥沙利铂耐药胃癌细胞系,检测其多项ABC超家族蛋白以及肿瘤干细胞蛋白表达情况,结果发现耐药细胞Nanog及ABCF2的高表达。多烯磷脂酰胆碱作用于胃癌耐药细胞后,结果发现耐药细胞奥沙利铂敏感指数明显增高,同时Nanog与ABCF2的表达降低,提示多烯磷脂酰胆碱可以逆转胃癌耐药细胞针对奥沙利铂的耐药。方法:1.细胞增殖检测采用MTT法检测细胞增殖指数:实验分为单药奥沙利铂组,加入不同浓度(0-16 μg/ml)的奥沙利铂100 μl;单药多烯磷脂酰胆碱组,加入不同浓度(0-64μmol/L)多烯磷脂酰胆碱100μ1;继续于培养箱中培养细胞24、48、72h后,分别在各孔中加入20 μlMTT后放室温中继续培养4h,然后行检测。药物联合组,奥沙利铂的浓度设定略低于48小时的IC50浓度3.5 μg/ml;多烯磷脂酰胆碱的浓度分别为0、2、4、8、16、32、64μmol/L。并将分组进行命名(分别为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲa,Ⅲb,Ⅲc,Ⅲd,Ⅲe,Ⅲf组)共同作用于胃癌细胞,继续于培养箱中培养细胞48h后,分别在各孔中加入20μ lMTT后继续培养4h,然后行检测。观察不同药物不同浓度不同作用时间对于胃癌细胞增殖的影响。2.药物合用指数针对联合作用组计算两者药物合用指数。利用金氏公式Q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)判断奥沙利铂与多烯磷脂酰胆碱的合并用药指数(Q值),其中Ea代表不同浓度的奥沙利铂对胃癌细胞的抑制率,Eb代表不同浓度的多烯磷脂酰胆碱对胃癌细胞的抑制率,E(a+b)为两种药物联合使用对于胃癌细胞的抑制率(即实测合并效应),Ea+Eb-Ea×Eb为期望产生的合并效应。若Q值在0.85～1.15范围内表示两药合用疗效为单纯相加,Q值1.15为两种药物产生了协同作用,Q值0.85则表示两种药物产生了拮抗作用。3.细胞周期检测检测联合作用组中各分组奥沙利铂的浓度设3.5 μ g/ml;多烯磷脂酰胆碱的浓度分别为0、2、4、8、16、32、64 μmol/L,共同作用于胃癌细胞,继续于培养箱中培养细胞48h,经PI染色标记后,用流式细胞仪进行分析,计算SGC-7901细胞处于不同细胞周期的比例。4.细胞凋亡检测检测联合作用组中各分组奥沙利铂的浓度设3.5 μ g/ml;多烯磷脂酰胆碱的浓度分别为0、2、4、8、16、32、64μmol/L,共同作用于胃癌细胞,继续于培养箱中培养细胞48h,经V-FITC和PI标记后,用流式细胞仪进行分析,计算SGC-7901细胞处于不同细胞周期的比例。5.细胞周期相关蛋白检测采用Westert blotting检测方法,检测联合作用组中各分组细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E 的表达情况。6.细胞凋亡相关蛋白检测采用Western blotting检测方法,检测联合作用组中各分组细胞周期相关蛋白Cytochrome c、Bax、Bcl-2、Bak、cleaved caspase-3、9 的表达情况。7.细胞活性氧(ROS)检测通过超氧化物歧化酶活性(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶活性(GSH-Px)活性和丙二醛含量(MDA)评估联合作用组中各分组细胞内氧化和抗氧化状态,观察ROS系统在联合作用组之间功能的差别。8.耐药细胞株的建立及其增殖活性本实验所采用的方法是逐步递增细胞培养液中奥沙利铂浓度、间歇作用于SGC-7901胃癌细胞,对其进行体外诱导筛选而获得。应用MTT法分别检测倍比稀释浓度的奥沙利铂对细胞的抑制率,进而确认所建义细胞系具有良好的耐药性和稳定性9.耐药细胞株ABC家族蛋白及肿瘤干性蛋白的表达采用Western blotting检测方法,检测诱导培养的耐药细胞株ABC家族蛋白ABCB1、ABCC1C、ABCF2及肿瘤干性蛋白Sox2、Nanog的表达情况。10.多烯磷脂酰胆碱对耐药株的奥沙利铂敏感指数的影响检测经与0.25umol/L、0.5umol/L、lumol/L、2umol/L多烯磷脂酰胆碱作用48h后,检测各个分组中SGC-7901/L-OHP对于L-0HP的IC50,计算其药物逆转指数。10.SGC-7901/L-OHP耐药株侧群细胞表达比例将 SGC-7901 与 SGC-7901/L-OHP 细胞经 Hoechst 33342 孵育 90min 后流式细胞仪检测,计算其各组SP细胞比例。11.多烯磷脂酰胆碱对耐药株ABC家族蛋白及肿瘤干性蛋白改变采用Western blotting检测方法,检测诱导培养的耐药细胞株ABC家族蛋白ABCF2及肿瘤干性蛋白Nanog的表达情况结果:奥沙利铂抑制肿瘤细胞的生长,且抑制强度与药物浓度及作用时间有关(F=194.193,P=0.0027;F=12.428,P=0.01)。不同浓度的多烯磷脂酰胆碱对胃癌SGC-790细胞的增殖活性不同,低浓度多烯磷脂酰胆碱可以促进胃癌细胞的增殖(F=373.769,P0.01),高浓度多烯磷脂酰胆碱可以抑制胃癌细胞的增殖。将不同浓度多烯磷脂酰胆碱与奥沙利铂联用后,Ⅰ、Ⅰ、Ⅲa-f组的细胞存活率分别为:100±0.18%,67.8±4.0%,38.9±4.7%,34.9±3.4%,39.3±5.5%,38.6±4.60%,37.7±2.6%,36.1±5.1%,联合作用组中药物合用指数,Q值分别为3.1、2.89、1.7、1.41、0.94和0.89。胃癌细胞在奥沙利铂与0-64μmol/L的多烯磷脂作用后Ⅰ、Ⅰ、Ⅲa-f组的G0/G1期细胞的比例分别是45.5±1.68%,68.1± 1.02%,86.5± 1.21%,87.2± 1.25%,87.8± 1.07%,86.1± 1.60%,87.9± 1.56%,90.1±1.11%,凋亡比例分别为 2.75±1.23%、9.5±1.45%、23.2±0.97%、27.5± 1.66%、22.2±1.39%、23.4±1.23%,24.1±1.31%、21.2± 1.13%,均较空白对照组明显增高,但是不同浓度多烯磷脂酰胆碱组间无明显差别(P=0.46;P=0.75)。Ⅰ、Ⅰ、Ⅲa-f组超氧化物歧化酶活性(SOD)分别为:40.8±1.81,23.5±1.68,22.5±1.21,21.8±1.76,22.7±1.70,20.7士 1.35,19.2±1.76,21.6±1.59U/mgprot,谷胱甘肽过氧化物酶活性(GSH-Px)分别为:25.3±1.15,11.9±1.57,10.9±1.10,11.2±1.85,10.4±1.97,11.1±1.60,11.9±0.97,10.4±1.34 U/mg prot,活性和丙二醛含量(MDA)分别为:4.1±0.13,8.3±0.36,8.2±0.76,8.6±0.59,7.9±1.03,8.1±0.65,8.0±0.77,7.6±0.89nmol/mg prot,在联合作用组较单药奥沙利铂组中表达无差别(P=0.88)。Western blotting检测结果显示,奥沙利铂作用胃癌细胞48h后,Cytochrome c在细胞液中的表达明显提高,同时发现凋亡前蛋白Bax表达明显增加而凋亡蛋白Bcl-2明显降低,而caspase-9和caspase-3均被分解成具有功能活性的片段,多烯磷脂酰胆碱可增强奥沙利铂的上述作用,但其增强作用与多烯磷脂酰胆碱浓度无明显相关(P=0.35)。细胞周期调控蛋白表达的结果显示,奥沙利铂降低了细胞因子D1和E的表达,与多烯磷脂酰胆碱联合作用后,奥沙利铂抑制细胞因子D1和E表达的作用进一步增强(P=0.027),但在不同浓度中的差异无统计学意义(P=0.37)。诱导建立胃癌耐药细胞SGC-7901/L-OHP,使其可以在10μg/ml的奥沙利铂中稳定存活,Western blot检测ABC蛋白超家族结果显示,SGC-7901/L-OHP细胞与SGC-7901细胞中耐药基因ABCB1、ABCC1均低表达,SGC-7901/L-OHP细胞ABCF2蛋白的高表达,肿瘤干细胞标志物Sox2、Nanog结果显示,SGC-7901/L-OHP细胞与SGC-7901细胞中干细胞标志物Sox2均无明显表达,SGC-7901/L-OHP细胞Nanog蛋白的高表达。流式细胞仪检测SGC-7901与SGC-7901/L-OHP 和细胞中 SP 比例分别为 0.12±0.035%和 85.7±9.66%,两者之间的差异具有统计学意义(P0.01)。经与0.25umol/L、0.5umol/L、lumol/L、2umol/L多烯磷脂酰胆碱联合作用,SGC-7901/L-OHP细胞对于奥沙利铂敏感性增加,药物逆转指数分别为:4.24、6.09、3.80、2.15。同时发现各组SGC-7901/L-OHP细胞Nanog及ABCF2蛋白的表达均明显降低(P=0.023)。结论:1.奥沙利铂对胃癌细胞SGC-7901增殖起到抑制作用,其作用呈现出明显的剂量和时间依赖性。2.不同浓度的多烯磷脂酰胆碱对胃癌SGC-790细胞的增殖活性因浓度不同而表现出两面性,低剂量多烯磷脂酰胆碱促进肿瘤细胞增殖,高剂量多烯磷脂酰胆碱抑制肿瘤细胞增殖。3.药物联合公式显示,低浓度多烯磷脂酰胆碱(2-16μmol/L)与奥沙利铂呈现出协同抗胃癌增殖的作用。高浓度多烯磷脂酰胆碱(32-64μmol/L)与奥沙利铂呈现出单纯相加抗胃癌增殖的作用。4.联合作用组及单药组SOD、GSH-Px活性和MDA水平无差异,显示两药联合抗肿瘤作用与细胞活性氧(ROS)无明显相关。5.奥沙利铂抗肿瘤增殖作用为促使细胞增殖周期停滞并诱导细胞凋亡。6.多烯磷脂酰胆碱增强奥沙利铂诱导胃癌细胞凋亡及细胞周期停滞的作用,主要通过上调凋亡相关蛋白染色质c及激活其下游蛋白caspase-9、和caspase-3,并下调细胞周期调控蛋白细胞因子D1和E的表达水平,但两者协同抗肿瘤作用与多烯磷脂酰胆碱浓度无明显相关。7.SGC-7901/L-OHP细胞较SGC-7901细胞中SP高表达,同时出现Nanog及ABCF2蛋白的高表达。8.多烯磷脂酰胆碱可以恢复SGC-7901/L-OHP细胞对于奥沙利铂敏感性,其中,0.5umol/l多烯磷脂酰胆碱耐药指数最强。9.多烯磷脂酰胆碱逆转SGC-7901/L-OHP细胞对于奥沙利铂耐药,考虑与降低耐药细胞Nanog及ABCF2蛋白的表达有关。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

【参考文献】

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1 刘学兰;肖安菊;;多烯磷脂酰胆碱对肝癌大鼠肝细胞保护作用的研究[J];氨基酸和生物资源;2015年03期

2 张懿;倪鎏达;;抗氧化剂对肿瘤放化疗疗效的影响[J];肝脏;2014年02期

3 王宇亮;周向东;;肿瘤细胞内药物浓度与铂类药物耐药的研究进展[J];肿瘤防治研究;2013年09期

4 王强;;多烯磷脂酰胆碱治疗肝功能异常的临床疗效观察[J];中国医药指南;2012年24期

5 张立阳,赵玉沛,吴元德,廖泉,郭俊超,刘子文,张太平;胰腺癌阿霉素耐药细胞株SW1990/ADM的建立及其耐药机理研究[J];中国普外基础与临床杂志;2005年01期

6 黄进,杨国宇,李宏基,熊程辉,李留安,吴玉臣;抗氧化剂作用机制研究进展[J];自然杂志;2004年02期

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本文编号：1292594