橄榄苦苷和异荭草苷对胶质瘤的抑制作用及其机制研究

发布时间：2017-12-15 21:08

  本文关键词：橄榄苦苷和异荭草苷对胶质瘤的抑制作用及其机制研究

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【摘要】：背景：胶质瘤是成年人最常见的颅内原发性恶性肿瘤,尽管在过去的几十年中,胶质瘤的治疗在放化疗和手术方面取得了很大进展,然而其中位生存期仍然只有12-14个月。胶质瘤患者预后差和死亡率高的主要原因是胶质瘤细胞具有很强的局部侵袭和迁移能力,从而导致手术不能将其完全切除,复发率高。另外,胶质瘤细胞能够招募并诱导肿瘤微环境中的非肿瘤细胞促进胶质瘤进展。在胶质瘤微环境中,巨噬细胞是胶质瘤细胞招募的主要免疫细胞之一。最近研究表明,胶质瘤组织内巨噬细胞的数量与胶质瘤进展呈正相关。上述问题表明,找到能够针对胶质瘤细胞和胶质瘤微环境的治疗方法将对胶质瘤的治疗提供帮助。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中含量最丰富的免疫细胞,占胶质瘤微环境中非肿瘤细胞总数的10%左右。巨噬细胞活化有两种主要途径：巨噬细胞活化的经典途径(也被称为M1)和替代途径(也被称为M2)。经典活化的巨噬细胞(也被称为M1巨噬细胞)由IFN-y和Toll样受体(TLR)激动剂如LPS诱导,高表达MHC Ⅱ类分子和CD86分子,并分泌大量的TNF-α,IL-6和NO。替代途径激活的巨噬细胞(又称M2巨噬细胞)由Th2细胞产生的细胞因子IL-4和IL-13诱导,低表达MHC Ⅱ和CD86分子,可释放大量抗炎因子如IL-10和TGF-p。研究表明,在恶性胶质瘤组织内分布的巨噬细胞主要为M2亚型,M2型巨噬细胞的数量与胶质瘤患者的预后不良相关。橄榄苦苷(Oleuropein)是一种从橄榄树中提取的主要酚类成分之一,在多种肿瘤包括乳腺癌、甲状腺癌,大肠癌和前列腺癌显示出一定抗癌活性。另外,研究表明,肿瘤细胞内的关键细胞信号转导通路如NF-κB, PI3K-Akt, MAPK和HIF-1 α通路与橄榄苦苷的抗癌活性相关。在胶质瘤方面,Gulcin Tezcan等研究表明橄榄叶的提取物(Olea europaealeaf extract)能够抑制胶质瘤的增殖,尽管橄榄苦苷是橄榄叶的提取物的主要成分之一,然而,关于橄榄苦苷对人脑胶质瘤的作用及其机制仍然未有研究。异荭草苷(3,4',5,7-tetrahydroxy-6-C-glucopyranosyl flavone, Isoorientin,ISO),是人类饮食中较为常见的一种C-糖基黄酮类物质,存在于某些植物如海芋、毛竹、千屈菜、荞麦、败酱草等[3-8]。最近多项研究表明,ISO具有多种药理作用,如抗炎、抗氧化、抗菌和治疗疼痛等[9-12]。另外,一些研究表明ISO也具有潜在的抗肿瘤活性[13-15]。然而,ISO对人脑胶质瘤细胞的作用及其作用机制尚不明确。目的：1.橄榄苦苷对胶质瘤的抑制作用及其机制研究：(1)研究橄榄苦苷对胶质瘤细胞增殖的影响。(2)研究橄榄苦苷对胶质瘤介导的巨噬细胞迁移和M2极化的影响。(3)研究橄榄苦苷对胶质瘤STAT3通路的作用。(4)研究橄榄苦苷对胶质瘤STAT3通路下游基因(IL-6、IL-8、miR-21和miR-18lb)的作用。2.异荭草苷对胶质瘤的抑制作用及其机制研究：(1)研究异荭草苷对胶质瘤细胞增殖的影响。(2)研究异荭草苷对胶质瘤Wnt/beta-catenin的作用。(3)研究异荭草苷对胶质瘤miR-23a表达的作用。(4)在胶质瘤细胞中研究miR-23a对Wnt/beta-catenin信号通路的调控。方法：1.橄榄苦苷对胶质瘤的抑制作用及其机制研究：(1)以U87和U251胶质瘤细胞作为研究对象,采用MTT和BrdU内吞实验检测橄榄苦苷对胶质瘤细胞增殖的影响。(2)以THP1单核细胞为研究对象,采用Transwell细胞迁移试验检测胶质瘤细胞招募胶质瘤相关巨噬细胞的能力,研究橄榄苦苷对胶质瘤相关巨噬细胞向胶质瘤细胞迁移的影响。(3)以THPl单核细胞分化的巨噬细胞为研究对象,ELISA技术检测巨噬细胞上清IL-10含量,、Vestern-Blot技术检测巨噬细胞内STAT3、p-STAT3水平,免疫荧光技术检测巨噬细胞CD163表达水平,研究橄榄苦苷对胶质瘤介导的巨噬细胞向M2型极化的影响。(4)以U87和U251胶质瘤细胞作为研究对象,Vestern-Blot技术检测胶质瘤细胞内STAT3、p-STAT3表达水平,ELISA技术检测胶质瘤细胞上清IL-6、IL-8含量,RT-PCR技术检测胶质瘤细胞内miR-21和miR-181b表达水平,研究橄榄苦苷对胶质瘤STAT3通路及其下游基因的作用。(5)以四周龄的BALB/c裸鼠为研究对象,将100μL细胞溶液(含有5×106U25l胶质瘤细胞)皮下注射到小鼠的右侧,当肿瘤长到平均约50-100立方毫米大小时,将造模成功的小鼠随机分为两组：橄榄苦苷作用组和对照组,每组5只,给药方式为口服,剂量为5OOmg/kg/day,每周给药5次,连续给药4周,对照组给予生理盐水。每7天测量一次肿瘤体积,肿瘤体积的计算公式：V=0.52×[L×W2],=体积,L=长度,W=宽度)。四周后将肿瘤组织取下,免疫组化检测肿瘤组织内CD163阳性细胞(肿瘤相关巨噬细胞)数量,Western-Blot技术检测STAT3、p-STAT3表达水平,RT-PCR技术检测胶质瘤组织内miR-21和niR-181b表达水平。2.异荭草苷对胶质瘤的抑制作用及其机制研究：(1)以U87和U251胶质瘤细胞作为研究对象,采用MTT和 BrdU内吞实验检测异荭草苷对胶质瘤细胞增殖的影响。(2)以U87和U25l胶质瘤细胞作为研究对象,Vestern-Blot技术检测胶质瘤细胞总beta-catenin和核内beta-catenin蛋白的表达情况,RT-PCR技术检测胶质瘤细胞内niR-23a表达水平,研究异荭草苷对胶质瘤Wnt/beta-catenin通路及miR-23a的作用。(3)利用转染试剂将miR-23a抑制剂或其阴性对照转染到胶质瘤细胞,研究niR-23a对胶质瘤Wnt/beta-catenin通路的调控。(4)利用皮下种植裸鼠胶质瘤动物模型检测异荭草苷是否影响体内胶质瘤的生长,并将肿瘤组织取下Western-Blot技术检测总beta-catenin和核内beta-catenin蛋白的表达情况,RT-PCR技术检测miR-23a表达水平。结果：1.橄榄苦苷对胶质瘤的抑制作用及其机制研究(1)MTT结果显示：橄榄苦苷对U87和U25l细胞存活的抑制具有时间和剂量依赖性。BrdU内吞实验结果显示：橄榄苦苷治疗明显抑制胶质瘤细胞的增殖。(2)Transwell迁移试验结果显示：橄榄苦苷明显抑制巨噬细胞向胶质瘤细胞迁移。(3)橄榄苦苷抑制胶质瘤细胞诱导巨噬细胞向M2型极化。1) ELISA结果显示：与对照组(不加橄榄苦苷)相比较,加入橄榄苦苷的胶质瘤细胞上清液能够抑制THP1细胞分化的巨噬细胞分泌IL-10。2) Western Blot结果显示：与对照组(不加橄榄苦苷)相比较,加入橄榄苦苷组巨噬细胞内p-STAT3水平较低,而STAT3表达水平无明显变化。3)免疫荧光结果显示：与对照组(不加橄榄苦苷)相比较,加入橄榄苦苷组巨噬细胞CD163阳性率较低。(4)橄榄苦苷抑制胶质瘤细胞STAT3信号通路。1) Western-Blot结果显示：与对照组(不加橄榄苦苷)相比较,橄榄苦苷明显抑制胶质瘤细胞STAT3和p-STAT3表达水平。2) ELISA结果显示：与对照组(不加橄榄苦苷)相比较,橄榄苦苷明显抑制胶质瘤细胞IL-6和IL-8表达水平。3) RT-PCR结果显示：与对照组(不加橄榄苦苷)相比较,橄榄苦苷明显抑制胶质瘤细胞miR-21表达,而miR-181b表达水平无明显变化。(5)体内验证橄榄苦苷对胶质瘤的抑制作用。1)给予橄榄苦苷治疗组胶质瘤的生长速度明显降低。2)免疫组化分析结果表明,橄榄苦苷治疗明显抑制胶质瘤组织内CD163阳性细胞(M2型巨噬细胞)的浸润。3)RT-PCR分析结果表明,橄榄苦苷治疗明显抑制胶质瘤组织miR-21表达,而miR-181b表达水平无明显变化。4) Western-Blot技术分析证实,橄榄苦苷治疗明显抑制胶质瘤组织STAT3和磷酸化STAT3水平。2.异荭草苷对胶质瘤的抑制作用及其机制研究：(1)MTT结果显示：异荭草苷对U87和U251细胞存活的抑制具有时间和剂量依赖性。BrdU内吞实验结果显示：橄榄苦苷治疗明显抑制胶质瘤细胞的增殖。(2) Western-Blot结果显示：与对照组(不加异荭草苷)相比较,加入异荭草苷组胶质瘤细胞内总beta-catenin和核内beta-catenin蛋白的表达水平较低。RT-PCR结果显示：与对照组(不加异荭草苷)相比较,异荭草苷明显抑制胶质瘤细胞niR-23a表达。(3) Western-Blot结果显示：与对照组相比较,miR-23a抑制组胶质瘤细胞总beta-catenin和核内beta-catenin蛋白的表达水平较低。(4)体内验证异荭草苷对胶质瘤的抑制作用。1)给予异荭草苷治疗组胶质瘤的生长速度明显降低。2) Western-Blot技术分析证实,异荭草苷治疗明显抑制胶质瘤组织总beta-catenin和核内beta-catenin蛋白的表达水平。3)RT-PCR分析结果表明,异荭草苷治疗明显抑制胶质瘤组织miR-23a表达。结论：通过体内外实验,我们发现橄榄苦苷可以抑制胶质瘤细胞的增殖,抑制胶质瘤细胞介导的巨噬细胞迁移和M2极化；STAT3信号通路以及其下游基因IL-6、IL-8和miR-21与橄榄苦苷的抑制胶质瘤作用有关。另外,我们发现异荭草苷可以抑制胶质瘤细胞的增殖；Wnt/beta-catenin信号通路与异荭草苷的抑制胶质瘤作用有关；miR-23a可以在胶质瘤细胞调控Wnt/beta-catenin信号通路的活性；异荭草苷通过抑制miR-23a表达抑制Wnt/beta-catenin信号通路的活性。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R273

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本文编号：1293418