阿司匹林在心肌纤维化中的作用及机制

发布时间：2017-12-17 10:04

  本文关键词：阿司匹林在心肌纤维化中的作用及机制

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【摘要】：研究背景近年来,缺血性心血管疾病致死率居高不下,并且其发病率呈现逐年上升的趋势。典型的缺血性心血管疾病包括心肌梗死(myocardial infarction,AMI)、冠心病、心绞痛以及心力衰竭等。然而,目前该类疾病的治疗与预防仍缺乏有效的临床药物。因此,缺血性心血管发病机理以及相关治疗药物的研发是目前该领域内亟待解决的问题。心脏纤维化是最常见的由缺血性心血管疾病引发的病理学特征。心肌梗死、心律失常、急性心肌缺血、心力衰竭,以及炎症和老化均会导致心脏纤维化。心脏纤维化能够导致心脏传导功能异常、舒张和收缩功能受损,诱发心脏功能严重紊乱。但是,纤维化的病理学发生过程还未明确;并且目前用于治疗心脏纤维化的药物不仅疗效低、生效慢而且副作用较强。因此,心脏纤维化的发病机理以及相关治疗药物均有待于进一步的探索。心脏成纤维细胞(Cardiac Fibroblasts,CFs)是哺乳动物心脏中除了心肌细胞外分布最丰富的细胞类型,大约占心脏内总细胞数的三分之二。传统观点普遍认为CFs的主要功能是分泌胶原蛋白形成细胞外基质从而维持心脏结构;但最近研究表明,心肌缺血后损失的心肌细胞无法通过细胞分裂补充,而是由CFs增殖、迁移分化为成肌纤维细胞,分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs),增加胶原蛋白的分泌等活动来修补缺失的心肌细胞,即心脏纤维化过程。另外,许多研究者认为CFs在心肌梗死后的炎症反应、伤口愈合以及心室重构等一系列病理条件下的心脏生理功能中发挥着重要的作用。所以,研究心脏纤维化的发病机理的关键在于研究缺血性心脏病发生以及病后心脏CFs的增殖、分化以及凋亡等一系列生物学过程。并且,探索现有药物以及小分子化合物对CFs的影响将会为相关疾病药物的研发提供一定的理论依据。阿司匹林,也称为乙酰水杨酸(aspirin,ASA),是广泛应用于心血管疾病的治疗以及预防的药物。阿司匹林可以有效地防止发生血凝块高风险患者的心脏病发作、中风和血凝块形成。据报道,ASA抑制血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)激活的CFs生长,胶原合成和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的生成。ASA还抑制细胞因子IL(interleukin)-18诱导的CFs迁移,表明ASA可能发挥着潜在的抗心脏纤维化作用,但ASA在体内心脏纤维化中具体的功能和分子机制基础机制仍不清楚。自噬是进化上高度保守的生理学过程,其主要功能是在胞内形成双层膜泡从而包裹长寿蛋白质和受损细胞器运往溶酶体降解。越来越多的证据表明自噬在维持心脏纤维化的心脏功能中起着至关重要的作用。ASA已被报道通过其抗血小板和抗炎功能来缓解心脏病。ASA对自噬的作用表现为细胞特异性;ASA通过激活PI3K/Akt-GSK3-mTOR通路抑制上皮自噬,而通过抑制mTOR信号诱导结肠直肠癌细胞自噬。那么,在心脏CFs中,ASA对自噬作用如何,以及通过何种信号通路目前还未明了。ROS是调控细胞命运的一个重要因素。作为抗氧化剂,ASA可广泛的减少ROS的产生。因此,ROS可能是介导ASA发挥作用的一个关键因子。此外,有研究证明心肌纤维化发病机理涉及ROS依赖的炎症细胞因子和MMPs的高表达,以及CFs的激活和迁移。同时,许多研究表明ROS-p38信号轴在心肌纤维化中发挥重要的作用。丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)是MAPK(ERK,JNK,p38激酶)家族中重要成员之一,其在ASA的功能发挥过程(如抗炎,抗肿瘤)中起到关键的作用。有报道指出p38的激活参与各种器官纤维化过程:抑制p38可缓解肾脏纤维化,而激活p38则促进肝脏纤维化。此外,研究表明氧化应激可通过p38途径参与自噬的激活。据此,我们提出假设:ASA可能通过ROS-p38途径影响CFs的自噬从而干预心脏纤维化过程。研究目的1.明确ASA对心脏纤维化的治疗作用。2.探讨ASA对CFs细胞自噬活性的影响。3.基于ROS、p38途径确定ASA对CFs细胞自噬的作用机制。研究方法1.采用异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)注射建立小鼠体内心脏纤维化模型。10周龄Bal10周龄b/c小鼠随机分为4组,每组6只:对照,ISO,ISO + ASA以及ISO +卡托普利。对照组给予生理盐水皮下注射。卡托普利为阳性对照。采用皮下注射ISO诱导心肌纤维化,剂量为前3天3 mg/kg/d,后18天6 mg/kg/d。给予ASA(10 mg/kg/d)灌胃处理。在ISO处理14天后,采用超声心动图初步评估心肌纤维化是否成功。灌胃21天后,2%异氟烷深度麻醉小鼠,脱颈处死。2.采用结扎左前降支建立小鼠心肌梗死(MI)模型。10周龄C57b1/6雄鼠随机分为3组:假手术组,MI,MI+ASA。MI组永久性结扎冠状动脉左前降支。假手术在冠状动脉左前降支下穿线不结扎。ASA在结扎后第二天给予ASA(10 mg/kg/d)灌胃处理,连续14天。3.从新生1到3天的SD大鼠心脏分离CFs,置入缺氧培养箱培养(95%N2,5%CO2)构建心肌纤维化体外模型。ASA处理组则加入不同浓度的ASA(0.5,2.5,5 mM)处理12小时。CFs在ASA加入之前进行自噬抑制剂胃蛋白酶抑制剂(PepstatinA,PepA),自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin),P38MAPK(P38)抑制剂SB203580或ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine,NAC)预处理1小时探讨ASA与自噬的关系,以及ROS/p38参与的机制。4.实验末检测:(1)采用超声心动图分析心脏功能,计算左室射血分数(left ventricular ejection fraction,EF),左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,FS)以及左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPW)的变化。(2)对心肌组织进行Masson三色、苦味酸天狼猩红染色,定量分析心肌组织胶原沉积,评价心肌纤维化程度。(3)采用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)细胞毒性检测,磺酰罗丹明B(sulfonylrhodamineB,SRB)染色以及5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)标记评估CFs细胞增殖和活性。(4)TUNEL染色和caspase3活性分析评估CFs细胞的凋亡情况。(5)2,7-双乙酸二氯荧光素(DCFH-DA)荧光探针标记法来测定ROS。(6)免疫印迹检测增殖(AKT),凋亡(caspase3和Parp1)和自噬(LC3-Ⅱ)蛋白的表达。所有数据均按照均值土标准误表达。用方差分析和Tukey post-hoc或t检验分析方法进行组间比较。P值0.05表示有统计学意义。研究结果1.所有的动物都完成实验,未见死亡。超声心动图结果表明ISO注射或MI构建都可显著导致小鼠EF,FS以及LVPW降低(P0.05)。Masson三色和苦味酸天狼猩红染色表明心肌损伤时,纤维化程度严重,表现较高的总胶原蛋白沉积。而ASA处理可逆转上述改变,减轻心脏损伤,阻滞心肌纤维化,显著降低心肌组织中总胶原蛋白的百分比。2.LDH细胞毒性,SRB染色,EdU标记以及AKT磷酸化水平降低共同证明了 ASA可通过抑制CFs增殖发挥其抗纤维化作用,且此过程成浓度依赖性(P0.05)。凋亡标记物,包括切割活化的caspase3和Parp1,也被ASA抑制,因此凋亡抑制是ASA抑制心脏纤维化时产生的副作用,此推测进一步通过TUNEL和caspase3活性分析得到确认。3.此外,研究还发现ASA能显著降低LC3-Ⅱ的表达(P0.05),提示其自噬抑制功能。当ASA联合使用自噬抑制剂PepA可降低LC3-Ⅱ的表达(P0.05)。与ASA一样,PepA能降低AKT磷酸化,提高ASA的功能,提示ASA可能通过抑制自噬发挥抗纤维化的作用。更重要的是,PepA不影响凋亡,Parp1表达未见变化。随后,我们采用自噬激活剂雷帕霉素联合处理CFs细胞,结果表明雷帕霉素可明显提高CFs细胞的增殖(P0.05),进一步确认了 ASA对CFs细胞增殖的抑制作用呈自噬依赖性。此外,结果表明ASA降低p38和Erk的磷酸化,但对JNK的磷酸化没有影响。p38抑制剂SB203580单独,或者联合ASA使用都可增加LC3-Ⅱ表达水平(P0.05),提示p38可以调节自噬。同时,SB203580促进ASA诱导的AKT磷酸化的降低,说明p38信号通路可能在ASA抗纤维化过程发挥重要的作用。与PepA 一样,SB203580对细胞凋亡同样没有影响,Parp1表达未见变化。我们的研究同样发现ASA可抑制CFs细胞产生ROS。与ASA和SB203580联合作用相似,ROS清除剂NAC可上调LC3-Ⅱ表达和抑制AKT的磷酸化(P0.05)。因此我们推测ROS也通过调节自噬参与ASA的抗纤维化作用。NAC也能抑制裂解caspase3的表达,提示ASA抑制凋亡呈自噬独立,ROS依赖的方式。结论1.通过ISO皮下注射和结扎左前降支,我们成功建立了心肌纤维化模型,为心肌纤维化发病机制的研究提供了可靠的平台。2.ASA处理可显著改善心肌纤维化程度,为开展ASA临床治疗提供依据。3.ASA通过自噬和p38/ROS依赖的信号通路发挥抗CFs增殖功能,从而缓解心肌纤维化的发展。PepA和SB203580不影响ASA介导的细胞凋亡抑制。因此,联合使用PepA和SB203580药物可能可增强ASA对心肌纤维化的治疗效果。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

【参考文献】

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本文编号：1299680