KLF4在卵巢癌中作用及机制的研究
发布时间：2017-12-17 10:32
本文关键词：KLF4在卵巢癌中作用及机制的研究
更多相关文章： 卵巢癌 KLF4 APTO-253 药物抵抗 细胞周期 卵巢癌 KLF4 APTO-253 上皮间质转化 转化生长因子-β
【摘要】：卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,发生率居妇科恶性肿瘤的第三位,死亡率位于女性生殖系统肿瘤首位。2012年全球卵巢癌新发病例52.98万,我国每年卵巢癌新发病例约13.15万,发病率是发达国家的6倍。卵巢癌呈现了治疗性挑战,因为其起病隐匿,早期无特征性的临床症状及特异性的分子标记物,约70%的患者确诊时已是晚期;并且该病极易发生侵袭、转移,手术难以根除,且术后易复发。肿瘤切除术及术后辅以铂类药物(顺铂)联合紫杉醇为主的基础化疗是标准的卵巢癌治疗方法。但化疗不仅易出现耐药性,而且给患者带来严重的毒副作用,导致临床上治疗效果不佳以及预后不良。然而,目前对卵巢癌的发生、发展机制以及卵巢癌细胞如何扩散到远处器官的机制并不清楚。因此,如何抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移;如何增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,提高对卵巢癌的治疗效果,提高患者的生存率和生活质量,逐渐成为人们研究的热点。KLF4(Kruppel-like factor 4)是锌指蛋白类转录因子家族中的一个转录因子,被称为多能编码干细胞基因之一,它在调控细胞的增殖、分化、细胞凋亡及胚胎发育等方面起着重要作用。转录因子KLF4已被证明在人类癌症中作为一个抑癌基因或癌基因,它的作用取决于细胞的微环境。目前已证实在结肠癌和前列腺癌中,KLF4是作为癌基因发挥作用。在肺癌、淋巴瘤、宫颈癌、胃癌、肝细胞癌等中,KLF4作为抑癌基因发挥作用。在乳腺癌中,KLF4作为癌基因或抑癌基因的作用仍有争议。KLF4在卵巢癌中的功能如何,目前仍不清楚。最近的研究结果表明,在卵巢癌中KLF4的功能是作为一个抑癌基因,它通过下调EMT发挥其抑癌基因的作用。EMT(epithelial to mesenchymal cell transition)是指上皮细胞在形态上转化为间质细胞并获得侵袭迁移能力的过程,这是肿瘤转移中一个基本的过程,在此过程中表现出上皮细胞发生上皮表型及细胞极性的改变,从而获得间质细胞的表型和功能,表现出对抗老化及凋亡,并具有从原位迁移侵袭的能力,在基质细胞相互作用下侵袭周围邻近组织,或通过侵入淋巴系统和(或)血液循环系统,转移并定植于其他部位形成转移灶。在EMT过程中伴有细胞表面标志物的变化:如上皮细胞标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达下调,β-连环蛋白(β-catenin)表达上调,间质细胞标志物vimentin(波形蛋白)表达上调,N-钙粘蛋白(E-cadherin)表达升高,以及转录调控因子Snail(Snail 1和Snail 2)等的活化。在卵巢癌细胞中,KLF4过表达可以抑制转化生长因子-β(TGF-β)诱导的EMT。所以,我们推测KLF4低表达有助于卵巢癌的耐药性和转移,因此诱导KLF4表达可能是治疗卵巢癌的一个新方法。在人类不同的癌症中,EMT与肿瘤的耐药性和转移能力有关。EMT是卵巢癌的一个突出特点,在卵巢肿瘤侵袭、转移等恶性进展中发挥非常重要的作用。实验证明KLF4过表达可减少肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。APTO-253是一种小分子化合物,在美国已经被批准应用于一些实体肿瘤的I期临床试验。既往的研究已证实APTO-253在人类白血病、肾癌等癌细胞系中通过诱导KLF4的表达具有抗肿瘤细胞增殖活性,能够阻滞细胞周期、促进细胞凋亡。因此我们设想在卵巢癌中,小分子诱导剂APTO-253能够诱导KLF4的表达,二者均可增加卵巢癌细胞对化疗药物紫杉醇、顺铂的敏感性,调节细胞周期及基因表达导致细胞周期停滞,促进化疗药物诱导的细胞凋亡,提高化疗药物疗效;通过诱导KLF4的表达抑制EMT,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移。第一部分在卵巢癌细胞中KLF4表达对提高化疗药物疗效的研究目的通过研究KLF4在卵巢癌组织中的表达,分析KLF4表达水平与患者生存率的相关性以及用APTO-253诱导KLF4表达或慢病毒载体介导的KLF4过表达的SKOV3及OVCAR3卵巢癌细胞对化疗药物紫杉醇、顺铂的治疗反应,探讨在卵巢癌治疗方面诱导KLF4表达是一个新颖治疗方法的可能性。材料和方法1研究对象卵巢癌细胞株:自美国菌种中心购买SKOV3和OVCAR3细胞系及HEK293FT细胞。组织标本:16例经病理证实为人卵巢癌标本和5例正常卵巢组织标本均来自美国田纳西州孟菲斯西南癌症医院。2研究方法(1)采用Real Time-PCR方法检测人卵巢癌组织及正常卵巢组织中KLF4的表达水平,并分析比较两者之间的差异。(2)通过组织免疫荧光染色方法测定人卵巢癌组织及正常卵巢组织中KLF4、PCNA的表达水平。(3)通过Kaplan-Meier分析卵巢癌数据库探讨KLF4的表达与患者生存率的相关性。(4)构建慢病毒载体,用慢病毒载体介导的KLF4过表达病毒及空载体转染卵巢癌SKOV3和OVCAR3两种细胞系,用嘌呤霉素筛选后建立稳定的KLF4过表达的细胞系。用不同浓度及不同的化疗药物紫杉醇(20nM、40nM)、顺铂(2μg/ml、4μg/ml)处理已建立的KLF4过表达的SKOV3和OVCAR3细胞系,通过用Caspase3/7系统测试方法检测细胞凋亡情况。(5)采用Caspase3/7系统测试方法测定卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞经APTO-253药物诱导后对化疗药物紫杉醇或顺铂处理的癌细胞凋亡改变情况。(6)应用Western blot方法测定不同浓度的紫杉醇或顺铂处理已建立的KLF4过表达的SKOV3和OVCAR3的细胞系以及经APTO-253药物诱导后SKOV3和OVCAR3卵巢癌细胞中Cleaved-PARP及Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平变化。(7)采用流式细胞术检测已建立的KLF4过表达的SKOV3和OVCAR3卵巢癌细胞系以及用APTO-253处理SKOV3和OVCAR3后细胞周期的变化。(8)APTO-253处理SKOV3和OVCAR3细胞,在不同时间点用Western blot方法检测细胞中的细胞周期相关蛋白CDK6、cMyc及p21的表达水平。3统计学分析实验数据采用SPSS21.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差(sx±)表示,两组间比较采用独立样本t检验进行统计分析,多组样本间差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),后续采用LSD-t两两比较,以α=0.05作为检验水准。结果1在卵巢癌组织中KLF4表达下调,KLF4低表达与卵巢癌高风险有关(1)与对照组相比,在癌症患者卵巢癌组织中KLF4表达显著下降。(2)采用组织免疫荧光染色方法检测人卵巢癌组织及正常卵巢组织中KLF4、PCNA的表达变化水平。卵巢癌组织中KLF4表达于细胞核,在正常组织中染色强,但在肿瘤区域染色弱;而细胞增殖标记物PCNA在肿瘤组织中染色强,在正常卵巢组织中染色弱。(3)KLF4低表达与预后不良和高级别卵巢癌患者显著降低的总体生存率密切相关。我们分析了Duke-OVC数据库中的133例卵巢癌患者,其中53例KLF4呈高表达,80例KLF4呈低表达,并且与KLF4低表达的患者相比,KLF4高表达的患者总生存期明显延长(P0.05)。在415例卵巢癌患者(GSE13876数据库)中208例KLF4呈高表达,207例KLF4呈低表达,KLF4高表达患者比低表达的患者有更高的生存率(P0.05)。此外,与低级别卵巢癌患者相比,高级别患者中KLF4表达水平显著降低(P0.001)。2慢病毒载体介导的KLF4过表达提高卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性(1)与对照组相比,KLF4过表达的SKOV3细胞中细胞凋亡大约增加2倍。当使用浓度为20nM和40nM的紫杉醇处理后KLF4过表达的SKOV3细胞凋亡大约增加2倍。同样,与对照组相比,KLF4过表达的OVCAR3细胞中细胞凋亡增加约3倍;当用浓度为20nM或40nM紫杉醇处理后KLF4过表达的OVCAR3细胞中细胞凋亡增加小于2倍。经紫杉醇处理后KLF4过表达的SKOV3、OVCAR3细胞中cleaved-PARP和cleaved-caspase-3表达水平明显高于对照组。(2)与对照组相比,使用浓度分别为0、2μg/ml和4μg/ml顺铂处理时,在KLF4过表达的SKOV3细胞中细胞凋亡约增加2倍。与对照组相比,用相同剂量的顺铂处理KLF4过表达的OVCAR3细胞,细胞凋亡大约增加3倍。经顺铂处理后KLF4过表达的SKOV3、OVCAR3细胞中cleaved-PARP和cleaved-caspase-3表达水平明显高于对照组。3 APTO-253诱导KLF4表达增强化疗药物的疗效在SKOV3和OVCAR3细胞中,APTO-253显著增强紫杉醇或顺铂诱导的细胞凋亡。并且在SKOV3和OVCAR3细胞中采用Western blot检测cleaved-PARP和cleaved-caspase-3表达水平,结果再次证明APTO-253增强紫杉醇或顺铂诱导细胞凋亡的效果,APTO-253联合紫杉醇或顺铂更易诱导细胞凋亡。4在卵巢癌细胞中KLF4表达导致细胞周期阻滞在KLF4过表达的SKOV3和OVCAR3细胞中KLF4过表达可导致细胞阻滞在G1期。与对照组细胞相比,在KLF4过表达的细胞中细胞周期相关基因CDK6和c Myc表达水平显著下降,p21表达水平明显上升。经APTO-253诱导的SKOV3和OVCAR3细胞中APTO-253抑制细胞周期并导致G1期阻滞,S期和G2/M期细胞显著减少,并且在一个时间依赖性APTO-253处理条件下,细胞周期相关基因CDK6和cMyc逐渐下调,而p21逐渐上调。结论1、卵巢癌患者中KLF4呈低表达,并且KLF4表达水平与卵巢癌患者的生存率及预后密切相关。2、首次发现,在卵巢癌细胞中APTO-253能诱导KLF4的表达,并且能够提高癌细胞对化疗药物的敏感性,增强化疗药物顺铂及紫杉醇的疗效。3、首次证实KLF4表达能促进卵巢癌细胞的凋亡和提高癌细胞对化疗药物的敏感性,可能是治疗卵巢癌的新策略,可以作为靶向治疗的靶点。4、在卵巢癌细胞中KLF4是一个通过抑制细胞周期导致细胞凋亡的非常关键的调节基因。第二部分APTO-253诱导KLF4表达对卵巢癌细胞生物学行为的影响及机制研究目的研究APTO-253诱导KLF4表达对SKOV3、OVCAR3两种卵巢癌细胞的增殖、侵袭及转移能力的影响及其相关机制,为临床卵巢癌的靶向治疗,提供新的理论依据和实验数据。材料和方法1研究对象细胞株:自美国菌种中心购买SKOV3和OVCAR3细胞系及HEK293 FT细胞。2研究方法(1)MTT法检测药物APTO-253诱导后SKOV3和OVCAR3两种细胞24h、48h、76h的生长增殖水平。(2)在SKOV3和OVCAR3两种细胞中,用Western blot方法在APTO-253诱导的不同时间点(0h、1h、3h、6h、12h、24h)检测KLF4及PCNA的表达水平。(3)细胞集落形成实验:测定药物APTO-253诱导后SKOV3和OVCAR3两种细胞的集落形成数目及大小。(4)细胞迁移实验检测药物APTO-253诱导后SKOV3和OVCAR3两种细胞转移能力的变化。(5)细胞侵袭实验检测药物APTO-253诱导后SKOV3和OVCAR3两种细胞的侵袭能力变化。(6)Western blot方法检测APTO-253诱导后KLF4的表达情况及SKOV3和OVCAR3细胞中E-cad、N-cad、Snail(slug)、β-catenin、Vimentin的表达水平。(7)Western blot方法检测SKOV3和OVCAR3细胞经APTO-253诱导24h后分别在实验组及对照组加入TGF-β30min、60min P-Smad2及Total-Smad2的表达情况。(8)Western blot方法检测慢病毒载体介导的KLF4过表达SKOV3和OVCAR3细胞中TGF-β诱导30min、60min P-Smad2及Total-Smad2的表达情况。3统计学方法实验数据采用SPSS21.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差(sx±)表示,两组间比较采用独立样本t检验进行统计分析,以α=0.05作为检验水准。结果(1)在SKOV3和OVCAR3细胞中,APTO-253诱导KLF4的表达显著抑制卵巢癌细胞的增殖。卵巢癌细胞经APTO-253诱导后MTT吸光度值下降明显,实验组与对照组在24h、48h、72h各时间点相比均有统计学意义(P0.001)。用Western blot方法在APTO-253诱导的不同时间点(0h、1h、3h、6h、12h、24h)检测KLF4及PCNA的表达水平,结果发现随着KLF4表达逐渐升高,PCNA的表达逐渐下降,并且呈时间依赖性。(2)在SKOV3和OVCAR3两种卵巢癌细胞中,与对照组相比,经APTO-253诱导KLF4表达后形成的集落数量明显下降,SKOV3细胞的实验组集落形成数量为43.333±7.638,对照组集落形成数量为86.667±11.930,两者相比差异具有统计学意义(P0.01),并且集落大小亦明显变小。OVCAR3细胞的实验组集落形成数量为82.333±7.506,对照组集落形成数量为163.667±5.508,两者相比差异具有极显著统计学意义(P0.001)。(3)在SKOV3和OVCAR3细胞中,APTO-253诱导KLF4的表达显著降低卵巢癌细胞的迁移能力。经APTO-253诱导后细胞的迁移能力明显下降,与对照组相比,结果具有统计学意义(P0.001;P0.01)。(4)在SKOV3和OVCAR3细胞中,与对照组相比,经APTO-253诱导后细胞的侵袭能力显著降低,结果具有统计学意义(P0.05)。(5)APTO-253诱导的KLF4表达抑制上皮间质转化。用Western blot方法检测细胞表面标志物E-cad、N-cad、Snail2(slug)、β-catenin、Vimentin蛋白表达水平,结果显示上皮细胞表面标志物E-cad表达上调,原癌基因β-catenin表达下调,间质细胞表面标志基因N-cad、Vimentin、转录因子Snail(slug)表达下调。(6)KLF4通过抑制TGF-β信号传导Smad途径从而抑制TGF-β诱导的EMT。采用Western blot方法分析APTO-253诱导的KLF4表达对TGF-β信号传导Smad途径中P-Smad2及Total-Smad2的表达情况,发现APTO-253诱导KLF4表达的细胞在不同时间点(30min、60min)P-Smad2表达均低于对照组,且结果有统计学意义。采用同样的方法对慢病毒载体介导的KLF4过表达细胞系进行检测P-Smad2及Total-Smad2的表达情况,结果亦显示KLF4过表达的细胞中P-Smad2表达均明显低于对照组,且结果有统计学意义。结论:1、首次证明在卵巢癌细胞中APTO-253可以诱导KLF4表达。2、KLF4在卵巢癌中发挥抑癌基因的作用,抑制了卵巢癌细胞的增殖能力,是细胞生长的负调节剂,显著降低卵巢癌细胞迁移及侵袭能力。3、KLF4可以通过抑制TGF-β信号传导Smad途径从而抑制TGF-β诱导的上皮间质转化。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.31
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;4例卵巢肿瘤中就有1例为恶性[J];山东中医药大学学报;2000年04期
2 金晓琴;形态罕见的卵巢肿瘤1例[J];现代中西医结合杂志;2000年07期
3 覃英姿;卵巢肿瘤并发阑尾炎1例报告[J];中国校医;2000年02期
4 韩卫红,李青,李霞;经阴道超声在卵巢肿瘤诊断中的应用[J];青岛医药卫生;2000年03期
5 ;卵巢肿瘤[J];国外科技资料目录.医药卫生;2000年10期
6 秦平,陈焰;二维超声及彩色多普勒联合应用对卵巢肿瘤的诊断[J];中国超声医学杂志;2001年07期
7 王月香;超声多普勒技术在卵巢肿瘤诊断上的新进展[J];河北医科大学学报;2001年06期
8 崔淑莉,徐爱哲,赵世强;经阴式彩色多普勒对卵巢肿瘤性质判定的临床意义[J];哈尔滨医药;2001年01期
9 史海英,姜胜健;卵巢肿瘤误诊13例分析[J];肿瘤防治杂志;2001年03期
10 赵信喜;微波快速石蜡切片诊断卵巢肿瘤206例分析[J];中国误诊学杂志;2001年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李利;王超英;林忠乙;;老年卵巢肿瘤82例分析[A];中国抗癌协会妇科肿瘤专业委员会第六次全国学术会议论文汇编[C];2001年
2 杨幼易;;老年妇女卵巢肿瘤手术治疗140例临床分析[A];中国抗癌协会妇科肿瘤专业委员会第六次全国学术会议论文汇编[C];2001年
3 杨帆;杨太珠;罗红;朱琦;郭文琪;田雨;陈娇;;生育前期女性卵巢肿瘤39例超声诊断[A];2005年全国医学影像技术学术会议西部论坛论文汇编[C];2005年
4 张海;李光展;吴瑛;卢俊;王慧芳;邓伟莲;;经阴道彩色多普勒血流图检测卵巢肿瘤血管的临床价值[A];中华医学会第六次全国超声医学学术年会论文汇编[C];2001年
5 洪树勋;许红;曹良杰;;801例卵巢肿瘤临床分析[A];纪念卓越的人民医学家林巧稚大夫诞辰100周年——全国妇产科高级学术论坛论文集[C];2001年
6 梁元姣;叶小勤;;老年妇女双侧卵巢巨大肿瘤1例报告[A];中国抗癌协会妇科肿瘤专业委员会第六次全国学术会议论文汇编[C];2001年
7 刘力;李冰琳;张启培;;836例卵巢肿瘤临床病理分析[A];第八次全国妇产科学学术会议论文汇编[C];2004年
8 陈晓玲;纪莉;吴晓燕;鱼红菊;王琳;;彩色多普勒超声在卵巢肿瘤诊断中的应用[A];第一届全国妇产科超声学术会议论文汇编[C];2006年
9 许幼峰;郭e，
本文编号：1299809
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/1299809.html
教材专著
