MiR-17调控骨髓间充质干细胞定向分化为类肠道干细胞及其对实验性结肠炎的影响

发布时间：2017-12-17 13:31

  本文关键词：MiR-17调控骨髓间充质干细胞定向分化为类肠道干细胞及其对实验性结肠炎的影响

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【摘要】：背景和目的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)为炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)的一种主要疾病类型,好发于青壮年,且容易反复发作,严重影响着患者的生活质量。目前已有的药物主要作用为控制肠道炎症活动和调节机体免疫,并不能达到粘膜愈合的效果。而粘膜愈合是治疗该疾病的根本目标。肠粘膜的修复始于肠道干细胞(ISCs)的分化与增殖,近年来用干细胞移植治疗IBD已经显现出一定的效果。但是肠道干细胞的分离与培养技术复杂,不利于被广泛推广使用。骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSCs)因其取材方便且具有多向分化潜能而备受关注。但是如何将BM-MSCs在体外扩增分化为肠道干细胞并有效送达受损肠段,以及相关机制均有待于探索。基于相关文献阅读,本研究拟在体外应用生长因子和miR-17,实现BM-MSCs →内胚层细胞→肠干细胞逐步分化,然后将GFP标记的类肠道干细胞,通过保留灌肠移植治疗实验性结肠炎,观察其归巢定植以及对肠道炎症的改善和粘膜修复的效果。第一节逐步诱导BM-MSCs分化为类肠道上皮干细胞目的:建立体外培养体系,将BM-MSCs逐步诱导为类肠道干细胞方法:提取骨髓间充质细胞,传至第三代,接种于6孔细胞培养板,加入不同浓度的Activin A(0,1,5,10,20,100ng/mL),培养5天,检测内胚层特异性基因Foxa2和Sox17表达变化,进而得出最优的Activin A浓度。然后加入最优浓度的Activin A,重复上述5天的培养,加入250ng/mLFGF2,培养4天,检测肠道干细胞特异性基因Lgr5和Musashi-1的表达量。结果:qRT-PCR,WB证实Activin浓度在5ng§/mL时,Sox和Foxa2表达量均最高。Activin A诱导5天后,Sox17和Foxa2的表达量显著上升。FGF2处理后,qRT-PCR和WB证实Lgr5和Musashi-1的表达量逐步上升,且差异具有统计学意义。流式细胞仪分析表明Lgr5+的细胞比例为30.06%。结论:BM-MSCs可在Activin A和FGF2作用下,先转变为Foxa2+和Sox17+的内胚层细胞,进而再转变为Lgr5+和Musashi-1+的类肠道干细胞。第二节miR-17协同生长因子促进BM-MSCs向类肠道干细胞分化目的:阐述miR-17在BM-MSCs向类肠道干细胞分化过程中的作用及相关机制方法:BM-MSCs按第一部分所述,在5ng/mL Activin A诱导为内胚层细胞,先成功转染miR-17,然后协同250ng/mLFGF2,诱导4天,检测Lgr5、Musashi-1和靶基因E2F1和WIFI以及β-catenin的表达量。免疫荧光和流式细胞仪进一步检测类肠道干细胞的表达比例,最后利用EGF诱导类肠道干细胞,观察其在体外是否可以分化为肠上皮细胞系。结果:miR-17可以抑制WIF1和E2F1的表达,增强Wnt/β-catenin通路的活性,进而显著提高诱导效率,不仅目的基因Lgr5和Musashi-1表达量上升,而且诱导时间缩短至2天,Lgr5+细胞比例为89.14%。类肠道干细胞在EGF作用下可继续分化为类肠上皮吸收细胞。结论:miR-17具有促进内胚层细胞转变为类肠道干细胞的作用,且其中的机制与激活Wnt/β-catenin通路活性有关。第三节观察GFP转基因的类肠道干细胞移植对DSS诱导的结肠炎的疗效目的:证明体外诱导分化的类肠道干细胞能够参与修复受损的肠粘膜方法:前期急性肠炎模型预实验表明3%DSS溶液成模效果最佳。30只6周龄的雄性C57BL/6小鼠,随机分为三组,分别为A(Control)组,B(DSS+PBS)组,C(DSS+ISCs)组。B和C两组小鼠自由饮用3%DSS溶液7天,分别于第7,9天通过保留灌肠注入1 × 106/150ul的细胞悬浮液和等量的PBS溶液。实验第14天,每组各处死5只小鼠,取肠组织做病理切片和冰冻切片,免疫荧光检测移植细胞定位。qRT-PCR和CBA法测肠组织和血清的炎性因子水平。一个月后,处理剩余小鼠,免疫荧光观察肠上皮细胞Muc2和CK-18表达。结果:在整个实验周期中,C组小鼠和B组相比较,体重减轻程度更小,恢复更快,未出现死亡小鼠,病理切片表明结肠受损程度更小,肠组织和全身炎症水平更低。免疫荧光检测可以观察到GFP细胞主要定植在肠道中下段,且干细胞具有归巢效应,可以定植在隐窝和肠上皮处,一个月后可分化为肠上皮细胞。结论:体外诱导分化的类肠道干细胞在实验性结肠炎小鼠肠道内定植,可以归巢到肠道损伤部位,修复受损肠组织,减轻肠道和全身炎症反应。结论1.BM-MSCs可在Activin A和FGF2作用下转变为类肠道干细胞;2.miR-17通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BM-MSCs转变为类肠道干细胞3.体外诱导分化的类肠道干细胞可定植在受损的肠粘膜,改善肠道的炎症状态。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R574.62

【参考文献】

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本文编号：1300306