补肾解毒方治疗多发性骨髓瘤的临床疗效及实验机制研究

发布时间：2017-12-17 20:10

本文关键词：补肾解毒方治疗多发性骨髓瘤的临床疗效及实验机制研究

【摘要】：目的多发性骨髓瘤是原发于造血系统的恶性肿瘤,虽然其总体生存率得到了改善,但其带来的骨痛,肾衰仍然影响患者的无事件生存。目前,临床上治疗多发性骨髓瘤的主要手段仍然是化疗。但化疗过程中出现的多药耐药现象,使患者的缓解率及无病生存率大大下降,最终出现复发。而随着新药及造血干细胞移植的引入,构建了"诱导——巩固——维持"的治疗方法,使患者的疗效有了很大的提高。但目前为止,多发性骨髓瘤仍然是不可治愈的疾病。多药耐药是影响难治性/复发性多发性骨髓瘤的最重要因素。因此,运用中医药,减低化疗副作用,为化疗增效,改善患者生存质量,提高无事件生存期,是提高多发性骨髓瘤的疗效的最好方法之一,因此,研究减毒增效的药物和方法在多发性骨髓瘤的研究领域中受到广泛的重视。多发性骨髓瘤属于中医"骨痹"范畴,其病机为"肾虚毒盛"。因此,我们根据多年临床实践,反复筛选,形成了临床上有效的补肾解毒方,组成为:半枝莲15g、白花蛇舌草30g、山慈菇15g、熟地20g、淮山30g、山萸肉15g、续断15g,骨碎补20g,补骨脂15g、莪术15g。我们发现临床上此方有较好的疗效。所以,本研究拟进一步阐明补肾解毒方的临床疗效及作用机制,为中医药治疗多发性骨髓瘤开辟新路径。基于以上理论,本研究拟用补肾解毒方对多发性骨髓瘤患者进行治疗,从分型分期,遗传学、流式细胞学、细胞免疫学指标对患者进行分层,对临床疗效进行评判;并通过实验,观察补肾解毒方含药血清对骨髓瘤细胞株作用的分子生物学指标,阐明补肾解毒方对多发性骨髓瘤的疗效,并试图阐明补肾解毒方的分子作用靶点。本研究包括临床与实验研究,旨在观察补肾解毒方配合化疗治疗多发性骨髓瘤的增效减毒方案,并探讨其对多发性骨髓瘤疗效的分子机制,初步研究补肾解毒方对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞在抑制生长、诱导凋亡方面的作用和通路,为补肾解毒方治疗多发性骨髓瘤提供有益的细胞学、分子生物学依据。方法:本研究分为临床研究与实验研究两部分一临床研究:(1)补肾解毒方对多发性骨髓瘤的临床疗效研究方法:入组2015年1月至2016年12月广州中医药大学第一附属医院血液科住院及门诊患者,符合多发性骨髓瘤诊断标准的初诊患者60例,按照随机原则分为实验组30例和对照组30例,实验组给予补肾解毒方配合常规化疗,对照组给予西医单纯化疗,两者治疗疗程为4周,连续3疗程以上评价疗效。评价指标为有效率(CR,VGPR,PR,NR),生存质量评分,症候积分,调节性T细胞水平。结论:补肾解毒方与对照组相比有较高的有效率,并且与单纯西医化疗对照组有统计学差异,而入组大部分病人获得了 PR以上疗效,说明补肾解毒方配合化疗有效率优于单纯化疗组(P0.05);补肾解毒方组与对照组相比,治疗后生存质量评分提高,与对照组相比有统计学差异(P0.05),说明补肾解毒方能提高骨髓瘤化疗患者生存质量;而对于症候积分评价,实验组与对照组治疗前后及组间比较均有统计学差异(P0.05)。证明补肾解毒方可能对化疗有减毒增效作用,但由于证候分型后,样本数量不足,尚待进一步扩大样本研究。而在分型各亚组分析中,我们可见补肾解毒方对IgG型骨髓瘤效果最好(P0.05);在危险分层疗效分析中,结果提示,实验组高危患者与对照组高危患者组相比,有统计学差异(P0.05),说明可能对高危型骨髓瘤,加入补肾解毒方后,比单纯的化疗有更好的疗效。不仅如此,本研究还发现,补肾解毒方组治疗前后比较,能下调调节性T细胞水平,有统计学差异(P0.05),说明补肾解毒方能下调多发性骨髓瘤患者调节性T细胞,调节多发性骨髓瘤患者免疫的作用。二实验研究(1)用QT-PCR法检测GRP78扩增基因的mRNA的表达方法:制备含药血清,并培养骨髓瘤细胞株RPMI8226,取对数生长期细胞,调整细胞数为1×105/ml,将调整后的细胞悬液100ul加入96孔的酶标板中,每组设8个平行孔,每一板次测定,均设一列空白对照组,将酶标板放置于37。C、5%C02浓度,饱和湿度条件下的培养箱内培养后,分别加入不同浓度的含药血清(空白对照组、补肾解毒方组、补肾解毒方+DDT组,DDT组)分别培养24h后,提取加入药物作用后的多发性骨髓瘤细胞的RNA,逆转录反应cDNA,然后进行QT-PCR反应,检测伴侣分子GRP78扩增基因mRNA的表达,获得数据。结论:通过用QT-PCR检测补肾解毒方含药血清对伴侣分子GRP78扩增基因的mRNA的表达的影响,证明补肾解毒方丸能下调GRP78基因的表达,由此推断,补肾解毒方的抗骨髓瘤作用机理之一可能是通过下调GRP78基因,使内质网应激,未折叠蛋白(UPR)活化加强,从而介导其骨髓瘤细胞凋亡。(2)用Western blot法检测Akt、FOX03a磷酸化水平以及Bim蛋白表达水平的剂量效应方法骨髓瘤细胞铢RPMI8226加入不同浓度的补肾解毒方含药血清(0,5,10,20umol/h)处理24小时,制备蛋白样本,在96孔板加入分别为浓度为0,1,2,4,6,8,9,10倍的蛋白标准液,加水20ml,再加上5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。在96孔板依次加入稀释的蛋白样品或原液10-20ml以及5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。测定蛋白含量,进行Western blot电泳,上样转膜,进行抗体孵育,免疫反应,然后成像,获取数据与图像。结论:结果表明,补肾解毒方能下调AKt,Fox03的表达,同时上调BIM的表达,并呈量效关系,这说明补肾解毒方可能通过干预AKt/Fox03/BIM信号转导,从而干扰细胞生存通路PI3K/Akt/BIM,拮抗NF-KB,起到促骨髓瘤细胞凋亡,抗骨髓瘤的效应。结论本研究发现,补肾解毒方结合化疗,能够提高患者的化疗有效率,提高患者生存质量,改善患者的无事件生存,并可能有减毒增效作用。同时,补肾解毒方能干预患者调节性T细胞,能加强机体对骨髓瘤细胞的免疫监视作用,调节免疫,促骨髓瘤细胞凋亡作用;补肾解毒方组经含药血清作用后,GRP78分子伴侣基因MRNA的表达下调,由此推断,补肾解毒方的抗骨髓瘤作用机理之一可能是通过下调GRP78基因,使内质网应激,未折叠蛋白(UPR)活化加强,从而介导其骨髓瘤细胞凋亡;补肾解毒方能下调AKt,Fox03,同时上调BIM的表达,并呈量效关系,这说明补肾解毒方可能通过干预AKt/Fox03/BIM信号转导,从而干扰细胞生存通路PI3K/Akt,拮抗NF-KB,起到促骨髓瘤细胞凋亡,抗骨髓瘤的效应。本研究初步说明了补肾解毒方的临床疗效及作用机制,但仍然需要扩大样本量进行进一步研究,另外,补肾解毒方的作用靶点及全面机制,尚待进一步研究总结。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R273

【参考文献】

中国期刊全文数据库前10条

1 刘波;白庆咸;陈协群;朱华锋;高广勋;顾宏涛;潘耀柱;;姜黄素对人多发性骨髓瘤细胞的抑制作用及其机制[J];肿瘤;2008年12期

2 潘铭;;中西医结合治疗多发性骨髓瘤21例疗效分析[J];中医药学报;2008年01期

3 刘琨;李达;张宏业;;87例多发性骨髓瘤的中医证型分析[J];新中医;2007年08期

4 任荣政;鞠立霞;;周永明治疗多发性骨髓瘤经验[J];中医杂志;2007年04期

5 李世辉;潘];薛芳;;青蒿琥酯对SP2/0骨髓瘤细胞的强效增殖抑制及促凋亡作用[J];中成药;2007年03期

6 李新成;;雄黄联合六味地黄丸治疗多发性骨髓瘤临床观察[J];湖北中医杂志;2007年03期

7 李秋柏;游泳;陈智超;邵菁;吕建;邹萍;;黄连解毒汤抑制多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增生及促凋亡作用的研究[J];白血病.淋巴瘤;2006年06期

8 常富业;王永炎;张允岭;李辉;李云;袁英;;毒损络脉诠释[J];北京中医药大学学报;2006年11期

9 陈鹏;丘和明;宋爽;杨洪涌;刘安平;沈云;冷晓明;蓝海;;补肾活血法辅助化疗治疗多发性骨髓瘤骨病16例疗效观察[J];新中医;2006年08期

10 张立山,戴雁彦,武维屏;毒损肺络与SARS[J];中国中医基础医学杂志;2003年12期