NADPH氧化酶在K-ras介导的胰腺癌发生发展中的作用

发布时间：2017-12-18 09:33

  本文关键词：NADPH氧化酶在K-ras介导的胰腺癌发生发展中的作用

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【摘要】：第一部分NADPH氧化酶活性抑制的p22phox敲除转基因动物的培育及其表型目的:为去除胰腺腺泡组织中NADPH氧化酶(NOX)的活性,拟在小鼠胰腺腺泡细胞中进行特异性的NOX的重要组分p22phox编码基因的敲除,并验证该模型是否能够在诱导突变后有效进行基因剪切。此外,评价p22phox敲除小鼠和内源性胰腺腺泡细胞特异性KrasG12D杂交后所的到的p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)转基因小鼠的胰腺组织表型。方法:首先获得Loxp-Stop-Loxp调控p22phox编码基因剪切的小鼠,与工具鼠fElaCreERT小鼠杂交,得到fElaCreERT;p22phox~(-/-)小鼠。该小鼠成年时予以Tamoxifen诱导突变表达,后提取小鼠胰腺组织DNA扩增相关片段后进行电泳分析,明确p22phox编码基因剪切情况。同时,将fElaCreERT;p22phox~(-/-)小鼠与f Elas Cre ERT;Kras~(G12D/+)小鼠杂交以获得f Elas Cre ERT;Kras~(G12D/+);p22phox~(-/-)小鼠。上述小鼠诱导突变后,表达后续目的基因突变。小鼠于150天龄处死,取胰腺组织进行病理学表型的分析,并提取胰腺组织蛋白进行Ras活性的检测。结果:fElaCreERT;p22phox~(-/-)小鼠成功诱导突变,成为胰腺特异性p22phox~(-/-)小鼠。fElaCreERT;p22phox~(-/-)小鼠与f Elas Cre ERT;Kras~(G12D/+)小鼠杂交,并诱导突变后得到p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠。对照组小鼠与p22phox~(-/-)小鼠对比,二者均未出现胰腺病变、胶原纤维沉积以及炎症细胞浸润。将Kras~(G12D/+)小鼠和p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠对比,发现Kras~(G12D/+)小鼠出现腺泡导管化生、胰腺导管上皮内瘤变、炎性细胞浸润以及炎症因子表达增高,而p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠仅小面积出现腺泡导管化生,胰腺导管上皮内瘤变的发生也受到抑制。Ras活性检测结果提示,Kras~(G12D/+)小鼠中活性Kras和活性Ras蛋白水平均增高,而p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠的活性Kras、活性Ras蛋白水平则与对照组类似。结论:我们成功构建了第一个p22phox胰腺腺泡细胞特异性敲除的转基因动物模型。与正常对照组相比,p22phox~(-/-)小鼠并未出现胰腺病变。此外,我们通过杂交成功获得了p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)胰腺腺泡细胞特异性敲除的转基因动物,与Kras~(G12D/+)小鼠相比,p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠胰腺病变程度减轻,炎症浸润和基质形成均减少,Ras激活水平得到抑制。第二部分p22phox敲除对高脂饮食合并Kras突变所致胰腺癌的作用目的:内源性的Kras突变不能够独立导致胰腺癌的发生,但可以与高脂饮食诱导的慢性炎症协同导致胰腺癌的发生。为了明确NADPH氧化酶在Kras突变和高脂饮食协同致癌过程中的作用,在本部分中拟利用p22phox敲除的小鼠模型进行探讨。方法:分别培育获得fElaCreERT小鼠,fElaCreERT;Kras~(G12D/+)小鼠以及fElaCreERT;Kras~(G12D/+);p22phox~(-/-)小鼠,并纳入普通饮食或高脂饮食实验组,诱导小鼠突变后称为Bac小鼠,KrasG12D+小鼠和p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠,予相应饮食处理。其中第一部分实验小鼠在达到150天龄时统一处死,取组织判断胰腺病变程度、细胞增殖水平、腺泡细胞损失、炎症浸润、胰腺星状细胞激活水平以及ERK通路激活水平。另一部分实验小鼠予以相应饮食处理后,长期喂养至其自然死亡,以观察不同处理组小鼠的生存期、胰腺癌转移情况。结果:首先,在150天龄处死的小鼠中,我们发现共18只高脂饮食处理的Kras~(G12D/+)小鼠中有8只(44.44%)出现胰腺导管腺癌,所有小鼠均出现不同级别的Pan IN病变,高级别Pan IN病变多见。而共10只高脂饮食处理的p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠中,无一例出现胰腺癌,8只出现Pan IN病变,而另外2只仅出现ADM病变。高脂饮食处理的Kras~(G12D/+)小鼠胰腺组织分析发现,实质细胞的增殖水平增高,表现为p16核染阳性率明显下降、Cyclin D1和Ki67阳性染色细胞增多,基质大量形成,胶原纤维沉积,星状细胞激活,胰腺正常腺泡损失比例高,中性粒细胞、巨噬细胞浸润包绕病变组织存在,实质细胞炎症因子COX2水平急剧升高。而高脂饮食处理的p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠胰腺组织中,上述病理性改变程度轻。此外,高脂饮食喂养的p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠胰腺组织中磷酸化ERK水平较Kras~(G12D/+)小鼠降低。在生存期观察的实验中,发现高脂饮食处理的p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠生存期比高脂饮食处理的Kras~(G12D/+)小鼠明显延长。结论:由p22phox敲除导致NADPH氧化酶失活性,能够减少胰腺组织中的ERK蛋白磷酸化,抑制Ras激活,减少基质中的炎症细胞浸润,有效的延缓高脂饮食合并Kras突变所致胰腺细胞恶变并延长小鼠的生存期。第三部分p22phox敲除对Kras突变协同胰腺炎症刺激致癌作用的影响目的:本部分实验中,为了明确急性、慢性胰腺炎症刺激与Kras突变的协同致癌作用能否被p22phox敲除所导致的NOX失活所抑制,我们采用了雨蛙素对转基因小鼠进行急性炎症刺激,并检测不同基因型小鼠胰腺的急性损伤以及损伤恢复情况。另外,我们采用了COX2胰腺腺泡细胞过表达的转基因小鼠,判断在COX2过表达造成胰腺持续性炎症损伤与Kras突变的协同致癌过程中,p22phox敲除是否产生影响。方法:首先培育小鼠,得到fElaCreERT小鼠,fElaCreERT;Kras~(G12D/+)小鼠以及fElaCreERT;Kras~(G12D/+);p22phox~(-/-)小鼠,分别纳入实验组,诱导突变后开始予以雨蛙素刺激。当雨蛙素处理结束后,分别于处理完毕后24小时和第10天处死小鼠,用于观察急性胰腺损伤以及损伤恢复情况。并采用Sirius Red染色法判断胶原纤维沉积,采用CD45,F4/80和MPO特异性染色评价胰腺组织炎症浸润水平。此外,量化评估了不同处理组小鼠腺泡细胞损失及胰腺星状细胞激活情况。在COX2过表达实验中,我们培育了f Elas Cre ERT;COX2小鼠,f Elas Cre ERT;p22phox~(-/-)小鼠,f Elas Cre ERT;p22phox~(-/-);COX2小鼠;f Elas Cre ERT;COX2;Kras~(G12D/+)小鼠以及f Elas Cre ERT;p22phox~(-/-);COX2;Kras~(G12D/+)小鼠。上述五种基因型的小鼠于成年后诱导突变表达,后分别于90天龄、180天龄和280天龄处死,取胰腺组织制成HE切片进行观察。结果:经过雨蛙素诱导急性炎症刺激后,Bac小鼠、Kras~(G12D/+)小鼠和p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠在处理完毕1天后均出现胰腺急性炎症损伤和炎性细胞浸润。而处理完毕后10天,Bac小鼠胰腺炎症损伤恢复;Kras~(G12D/+)小鼠胰腺则出现严重的纤维化,胰腺组织出现大量Pan IN病变,基质中炎症细胞大量浸润,胰腺腺泡损失严重;p22phox~(-/-)/Kras~(G12D/+)小鼠则未见病变加重,上述病理表现并不明显。在COX2过表达实验中,90天时处死的五个基因型小鼠均未见明显病变;180天龄处死的五个基因型小鼠中,COX2小鼠出现ADM病变和少量的低级别Pan IN病变,但p22phox~(-/-)/COX2小鼠并未出现明显的病变。COX2/Kras~(G12D/+)所有小鼠出现ADM和Pan IN病变,而p22phox~(-/-)/COX2/Kras~(G12D/+)小鼠出现ADM和少量低级别的Pan IN病变。280天龄时,所有的COX2/Kras~(G12D/+)均出现PDAC,而10只p22phox~(-/-)/COX2/Kras~(G12D/+)小鼠中,仅有4只出现PDAC,其余表现为各种级别的Pan IN病变。结论:p22phox敲除能够抑制Kras突变和雨蛙素导致的胰腺癌形成,阻止急性胰腺炎症在致癌基因突变的背景下出现持续加重。而在COX2过表达和Kras协同作用导致胰腺癌的过程中,p22phox敲除能够延缓PDAC的发生。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.9

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本文编号：1303678