基于β-淀粉样多肽的检测及其聚集体的行为机制研究

发布时间：2017-12-19 01:19

  本文关键词：基于β-淀粉样多肽的检测及其聚集体的行为机制研究

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【摘要】：阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD)是一种渐进性的神经退行性疾病,是老年痴呆中最常见的一种类型,约占痴呆人数的60-80%。随着人类寿命的不断延长,其发病人数在迅速增加,给社会和家庭带来了极大的负担。AD已经成为威胁老年人健康的主要疾病之一,其主要的临床症状为认知功能障碍、行为异常和记忆力减退。其确切的发病机制还不是很清楚,目前还没有有效的治疗方法和药物能够逆转、治愈AD。最近,研究人员发现淀粉样多肽(β-Amyloid,Aβ)的沉积和清除是引起AD的主要因素。大脑中的沉积物主要由Aβ(1-40)和Aβ_(1-42)聚集组成,其早在AD发病之前的几年或几十年已经开始演化。因此,Aβ浓度的变化能反映出AD疾病发展的进程。现阶段,Aβ(1-40)和Aβ_(1-42)已经被确立为诊断AD的标志物,精确的检测Aβ可为AD的早期诊断及后续治疗提供重要依据。此外,Aβ发生错误折叠会形成不同分子量的聚合物,比如寡聚体形态的Aβ(2至4个单体)、高聚体形态的Aβ(14至50个单体)。形成后的Aβ聚合物与神经细胞膜上的受体结合,并引发一系列突触损伤和神经毒性效应。然而,研究发现不同分子量的聚合物引起的神经毒性效应具有差异性,其具体机制还有待进一步阐明。双偏振极化干涉测量技术(Dual Polarization Interferometry,DPI)是一种高分辨的界面分析技术,主要用于对分子间相互作用进行实时定性和定量分析。基于上述研究背景,本论文构建了几种Aβ的检测体系并利用DPI研究了不同分子量的Aβ聚合物和膜受体结合时的动力学信息。1.基于抗体的特异性、银纳米粒子的光学特性以及Aβ与Cu~(2+)间的相互作用,构建了一种检测Aβ的比色免疫传感器。将Aβ(1-40/1-42)的特异性抗体通过偶联反应修饰到银纳米粒子表面,得到Antibody-AgNPs(Ab-AgNPs),此时溶液为亮黄色。将Aβ(1-40/1-42)和Cu~(2+)同时加入到Ab-AgNPs,抗体特异性结合Aβ,且Cu~(2+)与Aβ的第6、13、14位点咪唑基结合,导致Ab-AgNPs发生聚沉现象。随着Aβ(1-40/1-42)浓度的增加,银纳米粒子聚沉现象越来越明显,溶液由黄色逐渐变化到红色。紫外吸收光谱的变化与Aβ(1-40/1-42)浓度(0.25-150 nM)成线性关系,检测限(LOD,3σ/s)低至86 βM。该方法具有高灵敏度、高选择性、可视化、经济、操作简单等特点。2.利用Aβ_(1-42)的N-和C-末端两种不同抗体和金纳米粒子的光学特性,开发了一种检测Aβ_(1-42)的比色免疫传感器。通过离子和疏水作用,将两端抗体(C-Antibody(1-42),C-Ab(1-42);N-Antibody(1-42),N-Ab(1-42))分别修饰到金纳米粒子表面,并按照1:1比例混匀得到AuNPs@C/N-Ab(1-42)。Aβ_(1-42)加入后,由于 N-和C-末端抗体分别与Aβ_(1-42)结合而形成类似三明治结构。随着Aβ_(1-42)浓度的增加,AuNPs@C/N-Ab(1-42)溶液逐渐聚沉,溶液颜色从红色逐渐到蓝色变化。吸光度变化值△A与Aβ_(1-42)浓度(7.5-300 nM)呈良好的线性关系,检测限为2.3 nM(3σ/s)。该方法不仅保持了 ELISA中固有的特征(比如定量和特异性),而且还具有可视化、方便、操作简单等优点。3.利用DPI技术实时探究三种不同形态的Aβ(单体Aβ_(1-42)、寡聚体Aβ_(1-42),高聚体Aβ_(1-42))与ED1D2L受体间相互作用。将ED1D2L受体通过BS3交联剂固定在氨基化芯片表面。三种不同形态的Aβ分别流经芯片表面,实时获取相互作用过程中的参数信息,比如层质量、厚度、密度的变化。通过分析层质量的变化,首次精确测定了三种不同形态Aβ_(1-42)和ED1D2L受体(白细胞免疫球蛋白样B2的胞外结构域)间的结合速率(Association rate,ka)和解离速率(Dissociation rate,κd)。通过比较κa值,我们发现高聚体Aβ_(1-42)(1.34×105 M~(-1)·s~(-1))的结合速率比单体 Aβ_(1-42)(2.85×104 M~(-1)·s~(-1) 的结合速率快 5 倍,而寡聚体 Aβ_(1-42)(4.52×104M~(-1).s~(-1))的结合速率与单体Aβ_(1-42)基本保持一致。通过比较kd,我们发现单体Aβ_(1-42)(1.79× 10-2 s~(-1))和寡聚体Aβ_(1-42)(2.09 ×10-2s~(-1))的解离速度最快,其速率约为高聚体Aβ_(1-42)(5.34×10-4s~(-1))的30倍。由此说明,高聚体Aβ_(1-42)与ED1D2L受体具有很强的亲和力且停留在ED1D2L受体上的时间较长,可能引起异常的下游信号传导,进而导致一系列神经毒性效应。根据测定的动力学参数,可以帮助我们从动力学角度深入了解高聚体Aβ_(1-42)是如何在AD中引起毒性效应的,并且上述信息有可能为未来药物的发现和筛选提供帮助。
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R749.16;O657.3

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本文编号：1306354