极光激酶A对宫颈鳞状细胞癌的影响及其机制研究

发布时间：2017-12-19 07:06

  本文关键词：极光激酶A对宫颈鳞状细胞癌的影响及其机制研究

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【摘要】：目的:根治性放射治疗(有或无DPP为基础的化疗)是宫颈鳞状细胞癌最有效的治疗方法之一,但是因为治疗抵抗导致治疗效果仍然非常有限。在这项研究中,我们探讨极光激酶A表达与放射治疗反应和宫颈鳞状细胞癌患者预后的相关性。探讨用极光激酶A选择性小分子抑制剂MLN8237联合DPP、多西他赛对宫颈鳞状细胞癌细胞系(HCC94、SiHa)的体外影响,并检测MLN8237对宫颈永生化细胞系H8的影响以检测MLN8237对正常细胞的毒性反应,同时探讨用极光激酶A抑制剂对宫颈鳞状细胞癌放射治疗的影响及对化放疗增敏的机制。方法:1)采用免疫组化方法检测极光激酶A在未接受任何治疗的129例初始接受根治性放射治疗的维吾尔族宫颈鳞状细胞癌患者组织中的表达水平,放射治疗给予外照射+内照射(A点剂量70-85Gy)伴或不伴顺铂为基础的化疗,分析极光激酶A不同表达水平对预后意义。2)以MLN8237,DPP,多西他赛,各单药组作用于HCC94、Si Ha细胞,并设调零组及不加药对照组,采用MTT比色法测各组HCC94、SiHa细胞的增殖抑制率;3)以MLN8237高剂量处理H8细胞,MTT比色法检测细胞的增殖抑制率。4)以各药物小剂量浓度联合作用24h,采用MTT比色法测各组HCC94、Si Ha细胞的增殖抑制率。5)以三者1/2 IC50(48h)组合,IC50(48h)组合,采用MTT比色法测各组HCC94、SiHa细胞的增殖抑制率。6)以克隆形成实验验证以上MTT结果。7)以2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy放射剂量单独或联合MLN8237观察HCC94、Si Ha细胞平板克隆形成率,利用单击多靶模型拟合生存曲线,并计算外推值N,平均致死剂量D0和准阈剂量Dq以及放射增敏比SER。8)流式检测MLN8237处理HCC94、SiHa细胞后细胞周期、凋亡。MLN8237处理HCC94、SiHa细胞,设立对照,划痕检测迁移能力。MLN8237处理HCC94、Si Ha细胞,Q-PCR检测极光激酶A mRNA的变化,蛋白印迹检测极光激酶A蛋白、磷酸化(T288)极光激酶A蛋白的变化。结果:1)极光激酶A表达水平与宫颈癌不良预后相关的因素相关,包括淋巴转移(P0.001),肿瘤体积大(P0.001),低血红蛋白水平(P=0.011)和复发(P0.001)。极光激酶A高表达和低表达临床放射治疗反应有差异,极光激酶A高表达患者放射治疗反应相对抗拒(P0.001)。单因素分析显示淋巴转移、肿瘤大、低血红蛋白水平、极光激酶A过表达影响无复发生存和总生存。然而,多因素分析显示只有极光激酶A高表达可作为无复发生存(hazard ratio,3.953;95%CI,1.473-10.638;P=0.006)和总生存(hazard ratio 9.091;95%CI 2.597-32.258;P0.001)的独立预后因素。2)MLN8237单药处理细胞时,各组对HCC94、Si Ha细胞生存率均比对照组降低(P0.05),随着给药时间延长,细胞存活率逐渐降低(P0.05)。DPP、多西他赛也呈同样趋势。与对照相比,MLN8237的浓度高达80uM时没有引起H8细胞活性降低(P0.05),甚至高达320u M时仅导致小量毒性(细胞存活率85%)。3)MLN8237与DDP或者多西他赛联合处理各细胞24h时,各浓度联合作用组均较相同浓度单药存活率降低(P0.05)。MLN8237与DDP或者多西他赛联合组各药物之间有交互作用,各药物最高浓度联合组效果最好。三药1/2 IC50(48h)浓度联用HCC94、SiHa细胞存活率分别仅为15.859±4.657%,18.678±5.387%;三药IC50(48h)联用HCC94、Si Ha细胞存活率更低分别仅为6.957±5.846%,9.561±6.241%。进一步在平板克隆形成实验中也得到证实。4)单击多靶模型绘制出细胞辐射存活曲线,可见无论是HCC94细胞,还是SiHa细胞,联合组曲线较单纯照射组左移,且较为平直,“肩区”不明显。5)划痕实验检测MLN8237处理24h细胞,与对照组比较,明显抑制细胞迁移。流式细胞周期检测MLN8237处理HCC94、SiHa细胞,与对照组比较,G2/M期明显增加,多倍体细胞比例明显增高,G0/G1+S期比例明显降低(P0.05);流式细胞凋亡检测MLN8237处理HCC94、SiHa细胞,与对照组比较,凋亡细胞明显增多(P0.05),并随时间和剂量增加,变化越明显。6)MLN8237处理前后极光激酶A mRNA未见显著性差异,极光激酶A蛋白也未见明显变化,(T288)磷酸化极光激酶A蛋白表达显著被抑制,甚至表达消失。结论:1)极光激酶A高表达可预测放射治疗反应相对抗拒和预后相对差。2)在临床应用中,对不能耐受大剂量顺铂或多西他赛的患者,我们可以加适当剂量MLN8237,适当减少顺铂或多西他赛剂量,以期在不增加毒副反应的情况下,达到相同甚至更好的治疗效果。而对于毒副反应耐受的患者,我们应在机体耐受范围内,尽可能提高MLN8237和顺铂或者多西他赛的剂量,以充分发挥抗肿瘤效果。3)在临床应用中,小剂量选择性极光激酶A抑制剂MLN8237对宫颈鳞状细胞癌均有放疗增敏作用,相同剂量选择性极光激酶A抑制剂MLN8237对放射抵抗宫颈癌的放射增敏比与相对敏感的肿瘤相比相对更大;同时适当增大MLN8237剂量可增强放射增敏效果。4)MLN8237体外对化放疗的增敏机制可能通过显著抑制肿瘤细胞迁移能力,诱导肿瘤细胞G2/M周期阻滞、多倍体形成,诱导凋亡实现的。5)MLN8237在体外并不抑制转录水平,也不影响翻译水平,而是改变了极光激酶A空间构象从而影响了其活性。
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.33

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本文编号：1307299