食管癌干细胞DNA甲基化谱及相关基因DNMT1功能的研究

发布时间：2017-12-20 10:32

  本文关键词：食管癌干细胞DNA甲基化谱及相关基因DNMT1功能的研究　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：我国是食管癌的高发区,食管癌在我国的发生率位于恶性肿瘤的第三位,致死率位于第四位。鳞状细胞癌是我国食管癌常见的病理类型。虽然目前肿瘤的治疗有了长足进展,但食管鳞癌的预后仍然较差,极易出现侵袭、复发、及远处转移。肿瘤干细胞理论认为肿瘤治疗失败根源是因为肿瘤中肿瘤干细胞的存在。肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化的能力,治疗后残留的少量的肿瘤干细胞就可以引起肿瘤的复发、转移。所以研究肿瘤干细胞的干性维持机制,探索针对肿瘤干细胞的治疗方法,才有可能提高肿瘤治疗效果,防止肿瘤的复发,达到肿瘤的根治。近来研究表明肿瘤干细胞和非干细胞的区别可能不是在于基因组,应该更多的是表观遗传调控的不同。DNA甲基化作为表观遗传的重要调节方式,在肿瘤干细胞的调控中发挥着重要的作用。研究表明肿瘤干细胞与非干细胞具有不同的甲基化谱。而目前为止食管癌干细胞与非干细胞的甲基化谱尚没有研究。本研究从食管癌细胞系KYSE150和EC109分选出富集食管癌干细胞的SP细胞,在本实验室原代培养的食管鳞状细胞癌细胞Sl中分选出富集食管癌干细胞的肿瘤球细胞,利用减容代表亚硫酸氢盐测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)方法,对食管癌干细胞及非干细胞进行了甲基化测序。RRBS方法是利用限制性内切酶MspI对基因组进行酶切,从而将CpG位点富集出来,重亚硫酸盐(Bisulfite)处理,并进行高通量测序绘制单碱基分辨率的DNA甲基化图谱,是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法。本研究以食管癌干细胞和非干细胞的RRBS测序数据为主要分析材料,首先对测序原始数据进行过滤处理得到的高质量clean reads。通过Promoter及CpG岛的覆盖度和测序深度统计、全基因组C碱基甲基化水平统计、Promoter/CpG岛的甲基化分析、DNA甲基化信号在基因组的分布及DNA甲基化信号的基因组元件注释,绘制食管癌干细胞与非干细胞的甲基化图谱。采用的软件swDMR及T-test检验方法,找出干细胞与非干细胞的差异性甲基化区域(Differentially Methylated Region,DMR)。对差异甲基化相关的基因进行KEGG分析,对差异甲基化基因进行生物通路富集分析。并进行了差异甲基化基因功能富集(GO)分析。通过本研究我们绘制了食管癌干细胞与非干细胞的甲基化图谱,找出了 40个在肿瘤干细胞与非干细胞差异甲基化区域,筛选出了 13个差异甲基化基因,为DNA甲基化对食管癌干细胞的调控研究提供了理论基础。研究表明DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)作为DNA甲基化发生的重要酶,除了维持DNA的甲基化状态,在维持正常干细胞及多种肿瘤干细胞的自我更新及分化等干性方面有着重要作用。然而其在食管癌干细胞中的作用尚没有研究。食管癌干细胞缺乏特异的标志分子,分选较为困难。我们实验室在前期研究已证明食管癌侧群(Side population,SP)细胞具有食管癌干细胞的特性,而悬浮培养的食管癌肿瘤球细胞也更高的表达干细胞相关标记物如SOX2、OCT-4、BMI-1等,为食管癌干细胞的研究提供了良好的模型。故本研究采用了侧群细胞分选和悬浮肿瘤球培养的方法,从食管鳞癌细胞系分选出富集食管癌干细胞的SP细胞和肿瘤球细胞。我们首先检测了食管癌SP细胞和悬浮肿瘤球细胞中DNMT1的表达情况,并且用si-RNA干扰和DNMT1抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-dC)两种方法降低了食管癌细胞系KYSE150和EC109中DNMT1的表达,使用SP细胞流式检测、悬浮肿瘤球培养、裸鼠体内成瘤实验,检测了食管癌干细胞数量、自我更新能力及体内致瘤能力等干性的变化。通过细胞增殖实验、克隆形成实验、迁徙实验、药物敏感实验观察DNMT1敲除后肿瘤细胞增殖、克隆形成、迁徙及耐药等恶性表型的变化,并且检测了干细胞转录因子SOX2及干细胞相关抑制性miRNAs包括miR-203,miR-141,miR-200A和miR-200B的变化,对DNMT1调控食管癌干细胞标记物的表达进行了初步探索。实验结果显示DNMT1在富集食管癌干细胞的SP细胞和肿瘤球细胞中是高表达的,伴随着SP细胞向非SP细胞的分化,其表达降低。采用si-RNA干扰和5-aza-dC两种方法敲降DNMT1的表达后,KYSE150和EC109细胞中SP细胞的比例降低,悬浮培养形成肿瘤球的数量及体积均减少,裸鼠体内形成的移植瘤体积及重量也小于对照组,这说明敲降DNMT1后,食管癌干细胞的数量及自我更新能力降低。细胞增殖实验、克隆形成实验、迁徙实验、药物敏感实验的结果表明,DNMT1敲除导致食管癌干细胞受抑后,细胞增殖、克隆形成、迁徙及耐药能力均受到抑制。干细胞标记物SOX2的表达在DNMT1敲降后也是下降的,肿瘤干细胞相关抑制性 miRNAs 如 miR-203,miR-141,miR-200A 和 miR-200B 在 5-aza-dC 组表达是升高的,而在Lenti-sh-DNMT1组没有明显变化。本研究结果表明DNMT1对于维持食管干细胞的数量及自我更新等干性有着重要作用,从而进一步调控着食管癌细胞的恶性表型。DNMT1有可能成为针对食管癌干细胞治疗的新靶点。本研究为针对肿瘤干细胞的食管癌治疗提供了理论基础,有助于新的治疗药物或治疗方法的研发。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.1

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本文编号：1311783