肝细胞癌转移相关LncRNAs筛选及其作用机制研究

发布时间：2017-12-20 10:40

  本文关键词：肝细胞癌转移相关LncRNAs筛选及其作用机制研究　出处：《第二军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：原发性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,特别是在亚洲、非洲,肝癌发病率明显高于其它地区,并且肝癌致死率在我国恶性肿瘤中高居第二位;而肝癌中,肝细胞癌(HCC)大约占80%。因此探究肝细胞癌相关的癌基因或抑癌基因,研究肝细胞癌发生、转移机制对肝细胞癌的预防、诊断和治疗等均具有重要的实际意义。目前临床手术切除或者肝移植仍是治疗肝细胞癌最有效的治疗方法,但是一方面由于肝癌发病速度快,恶性程度高,多数患者在肝癌早期并没有明显的临床症状,大多数病人确诊时已属于肝癌晚期,错过了手术治疗的最佳时机,限制了手术治疗手段的应用;另一方面肝细胞癌易扩散转移、术后易复发,导致肝细胞癌患者的术后生存期较短,影响手术治疗的效果。和其他恶性肿瘤相同,肝细胞癌的发生、发展和转移是一个多基因参与、多步骤的、复杂的生物学过程,其中涉及到了许多基因的改变、肿瘤微环境等因素导致了肝实质细胞的的恶性转化。虽然,目前全世界已经尝试用高通量技术筛选技术对肝细胞癌的功能基因的突变谱及差异表达谱进行了研究,但目前临床上没有很好的诊断标志分子及治疗靶标。之前的大部分研究一直是以蛋白质编码基因为研究对象,随着非编码RNA研究的逐渐深入及高通量测序技术的不断发展和完善,近十年来,人们发现基因组可以编码大量长片段的非编码RNA,它们在生命活动及疾病发生中的作用也逐渐得到揭示。目前为止,在肝细胞癌中仍没有筛选到可以用于临床的诊断或预后的lncRNA分子。因此本研究采用基因表达谱芯片高通量技术并辅以生物信息学分析及实验技术筛选、验证与肝细胞癌转移相关的长链非编码RNA(lncRNA),并探讨其可能的临床意义。本文第一章,我们通过采用博奥生物集团有限公司的人类长链非编码RNA芯片对3对已经转移的肝细胞癌组织与癌旁组织及3对未发生转移的肝细胞癌组织与癌旁组织中lncRNA的差异表达谱进行筛选,得到与肝细胞癌转移相关的长链非编码RNA。在转移组肝癌样本中,我们发现179个lncRNA上调(例如HOXD-AS1和GOLGA2P10),76个lncRNA下调(例如HOTAIR)。然后我们对筛选得到的显著差异lncRNA在44例(20例未发生转移,24例发生转移)肝细胞癌组织及癌旁组织中进行验证。我们筛选到的一条具有较好临床意义的假基因编码的GOLGA2P10 Transcript1,其具有良好的临床相关性,并且TCGA中361例肝细胞癌病人的临床数据显示其可以作为HCC预后的候选标志分子(p=0.00512)。第二章,我们着重探讨GOLGA2P10在肝癌细胞中的的生物学功能和分子机制。我们通过细胞功能实验证实GOLGA2P10可以促进SMMC-7721、L02细胞增殖与迁移,但在HepG2细胞中未发现该促进效应。为了进一步阐明GOLGA2P10的分子机制,我们分析了GOLGA2P10的细胞定位和下游信号通路。我们首先运用RT-PCR及FISH技术对GOLGA2P10在细胞内的定位分布进行研究,发现其主要定位于细胞核中;然后我们运用表达谱芯片筛选GOLGA2P10影响的下游基因及信号通路,并运用生物信息学方法对筛选得到的差异基因进行GO分析、IPA分析,最后结合细胞生物学及分子生物学实验证明了GOLGA2P10可以上调FZD3、FZD6,激活Wnt信号通路,进而引起级联反应:上调MMP7促进细胞迁移;上调c-Myc,及其下游靶基因GLS1引起细胞代谢改变(脂代谢、谷氨酰胺代谢),增强SMMC-7721细胞在应激状态下的能量供应,促进细胞生存、增殖及迁移,而在细胞系HepG2中(HepG2中CTNNB1发生突变,缺少调控其降解的Ser/Thr结构域,因此不受上游信号调控),则不能激活Wnt信号通路,从侧面证明了我们的结论。因此GOLGA2P10可能是部分HCC病人的潜在治疗靶标。根据已有的RNA pulldown-质谱实验结果与结合在FZDs的启动子、增强子区域转录因子数据进行比对,我们推测GOLGA2P10应该是通过结合转录因子CTBP1介导增强子与启动子之间的相互作用促进FZD3、FZD6表达,但仍然需要RIP、CHIP及IP实验验证。第三章是研究HOXD-AS1促进肝细胞癌转移的作用机制,本课题组之前的一项研究证实HOXD-AS1在肝细胞癌中异常高表达,细胞功能实验证明其可以显著增强肝癌细胞系的迁移能力,我们对其具体机制进行了深入的研究,发现HOXD-AS1在细胞质与细胞核中均有分布,其可以通过多种机制参与肝细胞癌的转移。我们的结果证明HOXD-AS1可以竞争性结合miR-19a促进ARHGAP11A上调表达,促进肝癌细胞迁移。荧光定量PCR实验证实miRNA-19a在肝细胞癌组织样本中下调表达,ARHGAP11A在HCC样本中上调表达,并且HOXD-AS1与ARHGAP11A的表达水平呈正相关,r2=0.3393,也证实了细胞系中的结果。生存分析还显示ARHGAP11A表达高的病人生存期较短,预后较差。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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本文编号：1311806