Fgl2在炎性肠病及肿瘤微环境中的作用与机制研究

发布时间：2017-12-22 12:36

  本文关键词：Fgl2在炎性肠病及肿瘤微环境中的作用与机制研究　出处：《第三军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：第一部分:Fgl2在炎性肠病中的作用及机制研究结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,在全球恶性肿瘤中位居第三位,全世界每年有超过100万的新增确诊病例。已有相关研究表明,炎性肠病(Inflammatory bowel diseases,IBD)的炎症程度及病程时间与癌变风险呈正相关,流行病学研究显示大约20%的IBD患者会在30年内进展为肿瘤,并有50%以上死于肠癌。因此,深入阐明IBD发生发展的分子机制,发展新型的IBD治疗策略具有重要的科学意义。IBD包括溃疡性结肠炎(UC)和克隆恩氏病(CD),是一组临床上常见的以慢性肠道炎症为特征的消化系统疾病。近几十年来,IBD的发病率在全世界范围内逐年升高,因此通过深入研究IBD的发病机理,开发新型的IBD免疫治疗药物是目前IBD治疗领域的研究热点。其中,以抗TNF-α单克隆抗体为代表的免疫治疗手段在部分CD患者中能够有效缓解临床症状,但同时也发现相当大比例的UC和CD患者对抗TNF-α单克隆抗体的治疗无效。因此,深入探索IBD发病过程中肠道粘膜免疫系统中的改变及相关分子机制,将为IBD的治疗提供新思路和坚实的理论依据。纤维介素蛋白2(Fibrinogen-like protein 2,Fgl2)属于纤维介素相关蛋白超家族,是一种凝血酶原酶,催化凝血酶原Trombin向凝血酶Trombin的转化,从而促进凝血级联反应的发生。同时,Fgl2作为调节性T细胞(Treg细胞)的效应分子,通过抑制T细胞增殖,促进B细胞凋亡,抑制DC细胞的成熟发挥免疫抑制效应。新近研究发现,在IBD患者的血浆中,Fgl2的表达升高;同时在活跃期的IBD患者的结肠溃疡区检测到Fgl2的高表达,但Fgl2在IBD发生发展中的具体作用及机制仍不明确。因此,我们通过构建DSS诱导的小鼠结肠炎模型,及AOM/DSS诱导的小鼠结肠炎相关性肿瘤(CAC)模型,探讨Fgl2在IBD和CAC中的作用,并进一步探讨其可能的作用机制。主要研究方法:1.Fgl2在DSS诱导的小鼠IBD模型中的作用。(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中构建DSS诱导的小鼠IBD模型;(2)观察DSS诱导期间WT和Fgl2-KO小鼠体重下降程度、腹泻和便血等症状;(3)测量DSS诱导周期结束后WT和Fgl2-KO小鼠结肠的长度;(4)DSS诱导周期结束后,通过对WT和Fgl2-KO小鼠结肠组织进行切片和HE染色,对两组小鼠结肠组织病理改变进行评分;(5)DSS诱导周期结束后,提取WT和Fgl2-KO小鼠结肠组织总蛋白,ELISA检测两组小鼠结肠组织中促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17A)和抑炎因子(IL-4、IL-10和TGF-β)的表达。2.Fgl2在AOM/DSS诱导的小鼠CAC模型中的作用。(1)在WT和Fgl2小鼠中构建AOM/DSS诱导的小鼠CAC模型;(2)观察AOM/DSS诱导期间WT和Fgl2-KO小鼠体重的变化;(3)AOM/DSS诱导周期结束后,比较WT和Fgl2-KO小鼠结肠中的肿瘤数量及肿瘤负荷。3.Fgl2在小鼠IBD模型中的表达和定位。(1)在C57BL/6小鼠中构建DSS诱导的小鼠IBD模型;(2)在DSS诱导的不同时间点(第0天、第2天、第4天、第7天)处死小鼠,并测量结肠的长度;(3)对DSS诱导不同时间点的小鼠结肠组织进行切片和HE染色,观察上皮细胞屏障结构、炎性细胞浸润等的改变;(4)提取结肠组织总蛋白,Western Blot检测膜型Fgl2在DSS诱导不同时间点的表达;(5)ELISA检测分泌型Fgl2在DSS诱导不同时间点的表达;(6)流式分选IBD小鼠结肠组织中的各类细胞,包括肠上皮细胞(CD45-Ep CAM+),Treg细胞(CD4+CD25high),巨噬细胞(CD11b+F4/80+),DC细胞(CD11b+CD11c+F4/80-)和中性粒细胞(CD11b+Gr-1+F4/80-);(7)ELISA检测IBD小鼠结肠组织中各类细胞中分泌型Fgl2的表达;(8)免疫荧光检测IBD小鼠结肠组织中F4/80、CD11c和CD31与膜型Fgl2的共定位。4.造血细胞来源的Fgl2在IBD中的作用。(1)通过分离WT(CD45.2)和Fgl2-KO(CD45.2)小鼠的骨髓细胞,回输给经致死剂量辐照过的WT(CD45.1)受体小鼠,构建WT→WT和Fgl2-KO→WT骨髓嵌合小鼠模型;(2)取两组嵌合小鼠外周血进行CD45.1和CD45.2染色,流式细胞仪检测CD45.2在外周血白细胞中的比例,验证骨髓嵌合模型建立成功;(3)观察DSS诱导期间两组骨髓嵌合小鼠体重下降程度、腹泻和便血等症状;(4)提取两组骨髓嵌合小鼠结肠组织总蛋白,Western Blot检测膜型Fgl2的表达,ELISA检测分泌型Fgl2的表达;(5)测量DSS诱导周期结束后两组骨髓嵌合小鼠结肠的长度;(6)DSS诱导周期结束后,通过对两组骨髓嵌合小鼠结肠组织进行切片和HE染色,对两组嵌合小鼠结肠组织病理改变进行评分;(7)DSS诱导周期结束后,提取两组骨髓嵌合小鼠结肠组织总蛋白,ELISA检测两组嵌合小鼠结肠组织中促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17A)和抑炎因子(IL-4、IL-10和TGF-β)的表达。5.Fgl2通过调控肠道巨噬细胞极化在IBD中的作用。(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中构建DSS诱导的IBD模型;(2)分别在DSS诱导第6天和第9天,分离WT和Fgl2-KO小鼠结肠固有层中的单个核细胞;(3)流式细胞术检测WT和Fgl2-KO小鼠结肠组织中巨噬细胞、DC细胞和中性粒细胞的比例;(4)流式细胞术检测WT和Fgl2-KO小鼠结肠组织中M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的比例;6.体内和体外实验证明Fgl2对巨噬细胞极化的调控作用(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中构建DSS诱导的IBD模型;(2)流式细胞分选WT和Fgl2-KO小鼠结肠组织中的巨噬细胞,定量PCR检测两组小鼠结肠巨噬细胞中M1型和M2型巨噬细胞相关炎性因子和活性物质的表达;(3)分离WT和Fgl2-KO小鼠腹腔巨噬细胞;(4)LPS体外诱导WT和Fgl2-KO小鼠腹腔巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化,ELISA和定量PCR检测M1型巨噬细胞相关炎性因子和活性物质的表达;(5)IL-4体外诱导WT和Fgl2-KO小鼠腹腔巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化,ELISA和定量PCR检测M1型巨噬细胞相关炎性因子和活性物质的表达。主要研究结果:1.Fgl2在DSS诱导的小鼠IBD模型中发挥保护作用。(1)相较于WT小鼠,Fgl2-KO小鼠在DSS诱导期间体重下降程度更大、腹泻和便血等症状更严重;(2)Fgl2-KO小鼠在DSS诱导周期结束后结肠长度缩短更明显;(3)Fgl2-KO小鼠在DSS诱导周期结束后结肠组织病理评分更高;(4)相较于WT小鼠,Fgl2-K小鼠在DSS诱导周期结束后结肠组织中促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-17A)表达增加,抑炎因子(IL-10)表达减少。2.Fgl2抑制AOM/DSS诱导的炎性肠病相关肿瘤的发生。(1)Fgl2-KO小鼠在AOM/DSS诱导期间体重下降程度更大;(2)Fgl2-KO小鼠在AOM/DSS诱导周期结束后,结肠组织中肿瘤数量更多、肿瘤负荷更大。3.Fgl2在DSS诱导的IBD模型中的表达和定位。(1)随着DSS诱导时间的延长,IBD小鼠结肠长度逐渐缩短,上皮屏障结构破坏更加显著,炎性细胞浸润增加;(2)给予小鼠DSS诱导后,IBD小鼠结肠组织中膜型Fgl2表达增加;(3)给予小鼠DSS诱导后,IBD小鼠结肠组织中分泌型Fgl2表达增加;(4)在DSS诱导的IBD小鼠结肠组织中,巨噬细胞、Treg细胞和DC细胞是分泌型Fgl2的主要来源;(5)在DSS诱导的IBD小鼠结肠组织中,膜型Fgl2(m Fgl2)主要表达于巨噬细胞和DC细胞;4.造血细胞来源的Fgl2在IBD中发挥保护作用。(1)成功构建WT→WT和Fgl2-KO→WT骨髓嵌合小鼠模型,嵌合小鼠外周血中90%左右的白细胞均为CD45.2阳性,即来源于供体小鼠,证明骨髓嵌合小鼠构建成功;(2)接受Fgl2-KO小鼠骨髓的嵌合小鼠(Fgl2-KO→WT)在DSS诱导期间体重下降更多并且肠炎症状更严重。(3)Fgl2-KO→WT嵌合小鼠在DSS诱导周期结束后相较于WT→WT嵌合小鼠结肠长度更短,组织形态学病理评分更高;(4)Fgl2-KO→WT嵌合小鼠小鼠相较于WT→WT嵌合小鼠在DSS诱导周期结束后结肠组织中促炎因子表达增加。5.Fgl2通过调控肠道巨噬细胞极化在DSS诱导的IBD中发挥保护作用。(1)在DSS诱导的IBD模型中,Fgl2-KO小鼠结肠固有层巨噬细胞比例降低,DC细胞和中性粒细胞比例无明显差异。;(2)Fgl2-KO小鼠结肠固有层M1型巨噬细胞比例增加,M2型巨噬细胞比例降低。6.体内和体外实验证明Fgl2对巨噬细胞极化的调控作用(1)与WT小鼠相比,Fgl2-KO小鼠结肠组织中的巨噬细胞分泌M1型巨噬细胞相关细胞因子和活性物质增加,分泌M2型巨噬细胞相关细胞因子和活性物质减少;(2)体外巨噬细胞诱导分化实验中发现Fgl2可以直接调控巨噬细胞极化。主要结论:1.Fgl2在DSS诱导的小鼠IBD模型中发挥保护作用;2.Fgl2抑制AOM/DSS诱导的炎性肠病相关肿瘤的发生;3.Fgl2在DSS诱导的IBD模型中表达升高,肠道巨噬细胞、DC细胞和Treg细胞是Fgl2的主要来源;4.造血细胞来源的Fgl2在DSS诱导的IBD模型中发挥保护作用;5.Fgl2通过促进肠道巨噬细胞向M2型极化、抑制其向M1型极化,在DSS诱导的IBD中发挥保护作用;6.Fgl2直接调控巨噬细胞极化。第二部分:间质来源的Fgl2对肿瘤微环境的调控作用肿瘤微环境是由肿瘤细胞、间质细胞、细胞外基质及由肿瘤细胞和间质细胞分泌的细胞因子构成的一个整体。大量研究表明,肿瘤微环境在肿瘤发生和发展过程中发挥了重要作用。Fgl2属于纤维介素相关蛋白超家族,是一种凝血酶原酶,在多种疾病中高表达于巨噬细胞和内皮细胞表面。它通过催化凝血酶原Trombin向凝血酶Trombin的转化,促进凝血级联反应的发生。此外,Fgl2作为调节性T细胞(Treg细胞)的效应分子,通过抑制T细胞增殖,促进B细胞凋亡,抑制DC细胞的成熟等发挥免疫抑制效应。既往研究表明,Fgl2在多种实体瘤中表达升高,如肝癌、肾癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌等,并通过影响肿瘤细胞生物学功能促进肿瘤发生发展。新近在小鼠胶质瘤的研究中发现,胶质瘤细胞分泌的Fgl2可以上调肿瘤微环境中PD-1和CD39等免疫抑制分子的表达,并促进肿瘤微环境中免疫抑制性的细胞募集,从而促进肿瘤进展。但是,我们通过使用Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)数据库,对各类肿瘤细胞系中Fgl2的m RNA水平进行分析发现上皮细胞来源的肿瘤细胞系中Fgl2均为低表达,结合文献和我们此前在IBD中的研究,Fgl2在多种疾病中主要由免疫细胞表达,提示肿瘤间质细胞来源的Fgl2可能在肿瘤发生发展中发挥重要的作用。因此我们通过在Fgl2-KO小鼠中构建小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)皮下移植瘤模型,探讨间质细胞来源的Fgl2对肺癌肿瘤微环境的调控以及在肿瘤发生发展中的作用。主要研究方法:1.间质细胞来源的Fgl2在小鼠LLC皮下成瘤模型中的作用。(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中构建LLC皮下荷瘤模型;(2)接种肿瘤细胞后,每3天对肿瘤大小进行测量,并绘制肿瘤生长曲线;(3)荷瘤21天后,麻醉并处死小鼠,获取肿瘤组织并称重,比较两组小鼠肿瘤的重量;(4)Fgl2重组蛋白处理LLC细胞,CCK-8检测LLC细胞增殖的变化;(5)Fgl2重组蛋白处理LLC细胞,Annexin V/7AAD染色检测LLC细胞凋亡的变化。2.Fgl2对LLC肿瘤微环境的影响。(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中构建LLC皮下荷瘤模型;(2)荷瘤15天后,麻醉并处死小鼠,获取肿瘤组织,制备肿瘤组织单细胞悬液,流式细胞学分析肿瘤组织中CD45+细胞、TAM(F4/80+CD206+)、DC(CD11c+MHCII+)、MDSC(CD11b+Gr-1+)、Treg(CD4+Foxp3+)和CD8+T(CD3+CD8a+)细胞的比例;(3)q RT-PCR检测WT和Fgl2-KO小鼠肿瘤组织中NOS2、Arg1、VEGF和TGF-β的表达;(4)流式细胞学检测Na?ve及荷瘤状态下Fgl2-KO和WT小鼠骨髓和脾脏中MDSC细胞的比例;(5)q RT-PCR检测WT和Fgl2-KO小鼠肿瘤组织中CXLC12和CXCL5的表达;(6)人非小细胞肺癌RNAseq数据库中分析CXCL12和CD33、CD14的相关性。3.Fgl2对CAF细胞活化和功能的调控。(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中构建LLC皮下荷瘤模型;(2)荷瘤15天后,麻醉并处死小鼠,获取肿瘤组织,制备肿瘤组织单细胞悬液,流式细胞学分析肿瘤组织中CAF细胞的比例;(3)流式细胞术分选WT小鼠肿瘤组织中的CAF细胞,体外用重组Fgl2蛋白处理,q RT-PCR和WB检测CAF活化相关分子α-SMA,FAP,PDGFRα,)的表达;(4)流式细胞术分选WT小鼠肿瘤组织中的CAF细胞,体外用重组Fgl2蛋白处理,q RT-PCR检测CAF功能相关分子(CXCL12,HGF,TGF-β,VEGF和IL-6)的表达。主要研究结果:1.间质细胞来源的Fgl2促进LLC肿瘤的生长。(1)与WT小鼠相比,Fgl2-KO小鼠肿瘤生长明显减缓;(2)荷瘤21天后,Fgl2-KO小鼠肿瘤重量明显小于WT小鼠肿瘤重量;(3)在LLC皮下移植瘤模型中,Fgl2来源于肿瘤间质细胞。(4)Fgl2对LLC细胞增殖无影响;(5)Fgl2对LLC细胞凋亡无影响。2.Fgl2促进LLC肿瘤微环境中MDSC的募集。(1)荷瘤15天后,当两组小鼠肿瘤大小没有明显差异时,流式细胞学检测发现Fgl2-KO小鼠肿瘤组织中MDSC比例相较于WT小鼠明显降低;(2)相较于WT小鼠,Fgl2-KO小鼠肿瘤组织中NOS2、Arg1、VEGF和TGF-β的表达显著降低;(3)在Na?ve及荷瘤状态下,Fgl2-KO小鼠和WT小鼠的骨髓和脾脏中MDSC的比例无明显差异;(4)相较于WT小鼠,Fgl2-KO小鼠肿瘤组织中CXCL12表达降低;(5)在人非小细胞肺癌RNAseq数据库中,CXCL12的表达和CD33、CD14的表达成正相关。3.Fgl2促进CAF细胞的活化和功能。(1)荷瘤15天后,Fgl2-KO小鼠和WT小鼠的肿瘤中CAF细胞的比例无明显差异;(2)重组Fgl2蛋白促进CAF细胞活化相关分子(α-SMA,FAP,PDGFRα)的表达;(3)重组Fgl2蛋白促进CAF细胞功能相关分子(CXCL12,HGF,TGF-β和VEGF)的表达;(4)在人非小细胞肺癌RNAseq数据库中,Fgl2的表达和CAF活化及功能分子(FAP、PDGFRα和CXCL12)以及Fgl2和MDSC标志及功能分子(CD14、CD33和IL-10)的表达成正相关。主要结论:1.间质细胞来源的Fgl2促进LLC肿瘤的生长;2.Fgl2促进CAF细胞的活化及分泌CXCL12的能力;3.Fgl2通过上调肿瘤微环境中CXCL12的水平促进MDSC的募集。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R574;R735.35

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