乳头溢液及血液中乳腺癌相关MicroRNA筛选验证及其功能预测的研究

发布时间：2017-12-22 15:40

本文关键词：乳头溢液及血液中乳腺癌相关MicroRNA筛选验证及其功能预测的研究　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一,其早期诊断是重要的临床课题。MicroRNA(miRNA)是一种小的、非编码单链RNA,它在生物体内基本的生理过程、病理过程中发挥了重要的作用。很多研究结果证明,miRNA与肿瘤的发生、发展相关,可以作为恶性肿瘤的生物标记物。miRNA被证明存在于多种体液中并保持相对稳定,这为其成为肿瘤标记物提供了先决条件。目前关于乳腺癌患者的乳头溢液及血液中miRNA作为肿瘤标记物的领域尚需探索。第一部分乳头溢液中乳腺癌相关MicroRNA的筛选、验证与功能预测目的:1.证实乳头溢液中的miRNA的存在。2.筛选并验证乳腺癌与乳腺良性肿瘤乳头溢液中miRNA的差异表达。3.验证生理性乳头溢液——乳汁中miRNA的存在及其稳定性。4.运用生物信息学方法分析差异表达的miRNA的潜在作用机制。材料与方法:1.收集3例乳腺癌患者、3例乳腺良性肿瘤患者的乳头溢液,通过miRNA芯片筛选差异表达miRNA。2.在8例乳腺癌患者、13例乳腺良性肿瘤患者的乳头溢液中,通过实时定量PCR验证差异表达的miRNA。3.2例产妇乳汁于4℃放置0-72小时,使用实时定量PCR检测miRNA表达水平随时间的变化。4.使用Targetscan及miRDB软件预测miRNA的靶基因,然后进行GO分析、KEGG pathway富集、蛋白互作分析。结果:1.芯片结果提示:相比于乳腺良性肿瘤的乳头溢液,3个miRNA(miR-4484、miR-K12-5-5p、miR-3646)在乳腺癌的乳头溢液中表达上调,3个miRNA(miR-4732-5p、miR-4687-3p、miR-S1-5p)表达下调。2.经过实时定量PCR验证,证实在乳腺癌的乳头溢液中,miR-4484、miR-K12-5-5p、miR-3646 表达上调,而 miR-4732-5p 表达下调。3.乳汁在置于4℃的72小时内,其miR-3646、miR-4732-5p的表达水平相对稳定。4.许多肿瘤相关基因如 ADIPOQ、CPEB1、DNAJB4、EIF4E、APP 及 BCLAF1等是miR-4484、miR-3646、miR-4732-5p的潜在靶基因。通路富集分析发现,miR-3646的潜在靶基因与Rap1、TGF-β通路相关,miR-4484的潜在靶基因可能参与ErbB通路、雌激素通路、点状粘附通路,而miR-4732-5p的潜在靶基因可富集到癌症蛋白聚糖通路。蛋白互作分析提示,这些miRNA的潜在靶基因存在相互作用的可能。转录因子-靶基因调控分析发现,这些潜在靶基因受到ATF、CREB、C/EBPalpha、c-fos、c-Jun等重要肿瘤相关转录因子的调节。结论:在乳腺癌患者的乳头溢液中证实miR-4484、miR-K12-5-5p及miR-3646的表达上调,miR-4732-5p的表达下调。miR-3646、miR-4732-5p在乳汁中表达稳定性较好。生物信息学分析表明,miRNA可能通过调控肿瘤相关蛋白参与多个癌症相关通路。本研究为miRNA成为乳头溢液中乳腺癌肿瘤标记物提供了理论基础。第二部分血液中乳腺癌相关MicroRNA的筛选、验证与功能预测目的:1.筛选并验证乳腺癌患者与健康对照者全血中差异表达的miRNA。2.运用生物信息学分析差异表达的miRNA可能的作用机制及预后价值。材料与方法:1.收集6例乳腺癌患者、6例健康对照的全血样品,通过miRNA芯片筛选差异表达miRNA。2.在15例乳腺癌患者、13例健康对照的全血样品中,通过实时定量PCR验证差异表达的miRNA。3.miRWalk数据库用于预测miRNA靶基因,并使用DAVID工具寻找潜在靶基因显著富集的通路。利用网络数据库分析miRNA及其潜在靶基因在乳腺癌中的预后价值。结果:1.通过miRNA芯片共发现171个差异表达的miRNA,乳腺癌组与健康对照组相比有169个上调,2个下调。2.通过实时定量PCR证实了 5 个miRNA(miR-30b-5p、miR-96-5p、miR-182-5p、miR-374b-5p和miR-942-5p)在乳腺癌中上调。ROC曲线分析提示,这5个miRNA的表达可较好地区分乳腺癌患者及健康对照者。3.miR-30b-5p、miR-96-5p、miR-182-5p、miR-374b-5p 和 miR-942-5p 在早期乳腺癌患者全血中就已发生上调。4.共有855个基因被预测为5个miRNA的靶基因,其中ONECUT2是5个miRNA的共同潜在靶基因。公开数据的分析显示,这些miRNA和潜在靶基因与乳腺癌患者的生存相关。此外,这5个miRNA的潜在靶基因在许多癌症相关通路中显著富集,包括"MicroRNAs in cancer"通路,"Pathways in cancer"通路,FoxO信号通路,Ras信号通路,Rap1信号通路,MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路等。结论:本研究的数据支持 5 个 miRNA(miR-30b-5p,miR-96-5p,miR-182-5p,miR-374b-5p和miR-942-5p)作为全血中检测乳腺癌的新型肿瘤标记物的潜力,并表明它们可能参与乳腺癌发生和进展。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

【参考文献】