脐带间充质干细胞对肝损伤的治疗作用及其机制研究

发布时间：2017-12-22 21:36

本文关键词：脐带间充质干细胞对肝损伤的治疗作用及其机制研究　出处：《河北医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肝脏是人体内最重要和最复杂的器官之一。药物、饮酒、病毒等多种因素均可造成肝损伤,由此引发的肝炎、脂肪肝、肝硬化等在我国为常见肝脏疾病。肝损伤进一步发展形成的不可逆的肝衰竭是肝损伤患者死亡率较高的原因之一,而常规保肝治疗效果大多不理想。干细胞是一群具有自我更新和多向分化潜能的细胞。根据其来源的不同,分为胚胎干细胞和成体干细胞。脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells;UCMSCs)是存在于脐带血管周围组织华尔通胶中的一种来源于中胚层间充质的成体干细胞,相对于其它来源如骨髓、脐带血、脂肪等的MSCs,UCMSCs具有采集方便、来源丰富、分化潜能大、增殖能力强、低排斥免疫原性等显著的优点,可避免患者自体干细胞获取时的痛苦及自体来源数量的限制。它们具有独特的免疫调节作用、自我更新和跨胚层多向分化潜能等特点,正逐渐成为干细胞治疗的理想种子细胞。干细胞移植治疗作为原位肝移植治疗的有利补充和替代,为各种终末期肝病的治疗提供了新的思路和手段。在动物实验和临床研究中均发现,MSCs对肝纤维化、急性肝衰竭、药物性肝损伤有较好的治疗作用。然而,其发挥作用的机制尚未完全阐明。同时,干细胞最佳的移植方式和细胞治疗方案也未明确,临床长期疗效及安全性仍需进一步确证。这些均是制约干细胞广泛应用的因素。目前认为MSCs可能通过多种途径来发挥作用,主要有两种假设:(1)替补作用,定向分化为肝细胞发挥替代作用;(2)免疫调节作用,刺激原有肝细胞的再生和修复。两者可能相辅相成,共同发挥着治疗作用。免疫调节作用是干细胞所固有的特性,而干细胞的定向分化所受影响因素众多,如果找到影响干细胞定向分化的关键因素,给予适当的干预,将对干细胞的临床应用提供很大的帮助。为了更好地研究干细胞的定向分化,国内外研究者建立了不同的体外诱导方法,一般是通过不同浓度的各种细胞因子的诱导,诱导时间均在8-10周,存在诱导时间长,诱导效率低的弊端。已有研究表明干细胞周围的细胞及体液形成的微环境在干细胞的增殖和分化调控中发挥重要作用。当微环境发生变化时,干细胞可被激活,增殖或分化为不同类型的功能细胞。干细胞的分化涉及到各种受体的表达及其下游信号分子通路(如ERK、Wnt、Notch、MAPK、m TOR、JAK信号通路)的改变,不同的分化方向由不同的信号通路启动。研究发现UCMSCs可经体外诱导分化为各种组织细胞,而与肝细胞发育相关的转录因子和肝祖/干细胞标志物在UCMSCs中高表达,提示UCMSCs在向肝细胞分化方面可能更具有优势。另有研究报道,肝富集转录因子之一肝细胞核因子-4α(Hepatocyte Nuclear Factor-4α;HNF-4α)在胚胎发育肝细胞形成的过程中发挥重要作用。前人研究结果提示HNF-4α有可能在UCMSCs向肝细胞定向分化中发挥重要作用。有研究报道,HNF-4α是AMPK作用的一个新的靶点基因,进一步研究它们在UCMSCs向肝细胞定向分化中的关系,有助于阐明UCMSCs向肝细胞定向分化的分子机制。第一部分脐带间充质干细胞对肝损伤的治疗作用及体内定向分化研究目的:建立急性肝损伤和肝纤维化大鼠模型,观察并评价UCMSCs对两种肝损伤模型大鼠的治疗效果,研究静脉移植的UCMSCs在体内的行踪以及定居在肝组织内的干细胞的分化情况。方法:1无菌条件下,收集足月胎儿脐带,采用组织块贴壁法分离培养原代细胞。采用流式细胞术对UCMSCs免疫表型进行鉴定,对UCMSC体外分化潜能鉴定。应用荧光染料PKH26对干细胞进行荧光标记。通过腹腔单次注射50%CCl4制备急性肝损伤大鼠模型;采用TAA灌胃法制备肝纤维化大鼠模型。2实验分组1)急性肝损伤实验分组大鼠90只随机分为5组:正常对照组、模型组、溶剂对照组(通过尾静脉向模型大鼠注射500μL的生理盐水)、治疗组(通过尾静脉向模型大鼠注射浓度为2×106个/m L的干细胞悬液500μL)和治疗对照组(通过尾静脉向正常大鼠注射浓度为2×106个/m L干细胞悬液500μL)。每组分为3 h、2 d、7d三个时间点,每个时间点6只大鼠,分别在治疗后计划时间点处死大鼠,收集标本。2)肝纤维化实验分组大鼠120只随机分为5组:正常对照组、溶剂对照组、单次治疗组、多次治疗组和治疗对照组。单次治疗组治疗方法为成模后间隔1 w通过鼠尾静脉移植UCMSCs 1×106个后,分别在移植后3 h、2 w、4 w处死大鼠,收集标本;多次治疗组治疗方法为在成模后间隔1 w通过鼠尾静脉移植UCMSCs每周1次,连续4 w,每次移植量为1×106个,分别于最后一次治疗后1 w和1 y处死大鼠,收集标本。正常对照组未作任何处理,溶剂对照组注射相同体积的生理盐水,治疗对照组通过尾静脉注射1×106个干细胞悬液。各组在与治疗组相同的时间点处死6只大鼠,收集标本。3指标评价通过肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织冰冻切片中的荧光观察,跟踪UCMSCs移植后在大鼠体内的迁移。通过ALT、AST、MDA、TBIL的血清水平评价UCMSCs移植对急性肝损伤模型大鼠肝功能的影响,通过血清中BAM、TBIL、AKP、ALB、GLB的浓度评价UCMSCs移植对肝纤维化模型大鼠肝功能的影响。通过HE染色和Masson染色观察UCMSCs移植对肝脏组织病理结构的影响。采用免疫组织化学法观察UCMSCs在大鼠肝脏的定向分化。结果:1 UCMSCs的分离、培养和鉴定本实验室已成功从脐带原代培养出UCMSCs,经过10次传代细胞的形态和增殖能力无明显改变,经过细胞标志物表型鉴定高表达间充质细胞标志,不表达或低表达造血细胞、内皮细胞标志和主要组织相容性抗原,具有成骨和成脂的分化潜能。2荧光标记对干细胞的影响倒置显微镜下观察,UCMSCs经PKH26染色后,细胞形态与未标记的细胞相似,呈长梭形,漩涡状排列生长。在荧光显微镜下呈红色,标记率约为100%。从第3代UCMSC经PKH26染色后,经过5次传代,每代5天,细胞的荧光强度逐渐减弱,到第4次传代时,仍可检测到荧光。MTT结果显示两组细胞各时间点的活性无显著性差异(P0.05),说明荧光染色对细胞增殖无影响。3移植后UCMSCs在肝损伤大鼠体内主要脏器的分布治疗组肝脏组织中每个视野均可见PKH26标记的大量带红色荧光的UCMSCs,治疗对照组大鼠肝脏组织中亦可见荧光标记的UCMSCs,但数量远少于治疗组(P0.05)。治疗组脾脏和肺脏中亦可见荧光细胞(P0.05),与治疗对照组脾脏和肺脏中的荧光细胞数量相比显著降低(P0.05);两组心脏、肾脏和脑组织中均偶见荧光细胞。4移植后UCMSCs在肝脏的分布荧光显微镜下可见:大鼠的肝脏组织中有大量带红色荧光的细胞,即PKH26标记的UCMSCs,每个视野均可见,UMSCs主要分布在肝脏组织的汇管区及血管周围;每张切片随机选择3个不重复不重叠的视野照相并分析,与急性肝损伤组相比,正常对照组肝脏组织中荧光标记的UCMSCs数量显著降低(P0.05)。与PKH26标记阳性细胞数量相比,吞噬细胞标志物EMR1阳性细胞数量显著降低(P0.05),结果显示86.32%-99.76%的PKH26标记阳性细胞未显示EMR1阳性,说明这些细胞未被吞噬细胞所吞噬。5移植UCMSCs后对大鼠肝功能的影响1)移植UCMSCs后对急性肝损伤大鼠肝功能的影响与正常对照组相比,模型组大鼠血清24 h AST、ALT、MDA和TBIL水平显著升高(P0.01),提示造模成功。移植干细胞3 h、2d和7d后,与正常对照组相比,模型组和溶剂对照组大鼠各时间点血清AST、ALT、MDA和TBIL显著升高(P0.05或P0.01);与溶剂对照组相比,治疗组各时间点AST、ALT、MDA和TBIL水平显著降低(P0.05);与正常对照组相比,治疗2d组MDA和TBIL水平无显著性差异(P0.05),治疗7d组AST和ALT水平无显著性差异(P0.05)。2)移植UCMSCs后对肝纤维化大鼠体重和肝功能的影响在肝纤维化造模的过程中,与对照组相比模型组大鼠体重增长缓慢。UCMSCs治疗后,与正常对照组相比,模型组和治疗组大鼠体重均显著下降(P0.05),与模型组相比,4w与4t组大鼠体重均显著增加(P0.05)。与正常对照组相比,溶剂对照3h、2w、4w和4t组BAM、TBIL和AKP的血清浓度显著增高,ALB/GLB显著降低,溶剂对照1y组BAM显著升高(P0.05)。与溶剂对照组相比,治疗3h、2w、4w、4t、1y组BAM水平显著降低(P0.05),治疗2w、4w、4t组TBIL、AKP水平显著降低,治疗3h、2w、4w、4t、1y组ALB/GLB水平显著升高(P0.05)。1)移植UCMSCs对急性肝损伤模型大鼠肝脏病理结构的影响大鼠肝脏切片HE染色可见,对照组肝组织内可见呈放射状排列整齐的肝小叶结构,肝细胞形态完整;模型组肝脏组织可见大量炎细胞浸润,肝细胞变性、坏死严重。移植UCMSCs后,3h、2d和7d各组与模型组相比,平均每个视野炎细胞数量均显著下降(P0.05),2d和7d各组与模型组相比,平均每个视野坏死细胞数量均显著下降(P0.05)。2)UCMSCs治疗对肝纤维化大鼠肝脏病理结构的影响大鼠肝脏切片HE染色可见模型组大鼠肝脏切片可见大量增生的纤维组织,穿插并分割肝小叶形成假小叶,其中可见大量炎细胞和增生的胆管细胞。Masson染色可见,纤维组织被染成深蓝色,UCMSCs移植后,深蓝色纤维组织明显减少,治疗时间越长,纤维组织越少见,模型组大鼠1年后肝脏组织内可见胆管细胞重度增生,而治疗组大鼠肝脏组织结构接近正常。染色结果分析显示,与溶剂对照组相比,治疗2 w、4 w、4 t和1 y组肝脏纤维化程度均显著减轻,且治疗4 t和1 y组纤维化程度轻于治疗3 h、2w和4 w组(P0.05)。7 UCMSCs移植后在肝组织中定向分化为肝细胞1)UCMSCs移植后在CCl4所致肝损伤肝组织中定向分化为肝细胞肝脏切片免疫组织化学结果显示,UCMSCs移植后3 h,可检测到少量肝细胞特异标志物表达,但是未见到阳性肝细胞;UCMSCs移植后2d和7d,可见到阳性肝细胞,表达肝细胞标志物AFP、CK18,肝细胞功能蛋白ALB、TPH2。与正常对照组相比,各治疗组肝细胞标志物表达量显著升高(P0.05);与3h组相比,2d组与7d组AFP、ALB和TPH2的表达量显著升高(P0.05);与2d组相比,7d组CK18、AFP、ALB和TPH2的表达量显著升高(P0.05)。2)UCMSCs移植后在TAA所致肝纤维化肝组织中定向分化为肝细胞肝脏切片免疫组织化学结果显示,UCMSCs移植后3 h,可检测到少量肝细胞特异标志物表达,但是未见到阳性肝细胞;UCMSCs移植后2 w以后,可见到阳性肝细胞,表达肝细胞标志物CK18,肝细胞功能蛋白ALB、CYP3A4。与正常对照组相比,各治疗组肝细胞标志物表达量显著升高(P0.05);与3h组相比,2w、4w、4t与1y组ALB,CK18和CYP3A4的表达量显著升高(P0.05);与2w组相比,4w、4t与1y6移植UCMSCs对肝损伤模型大鼠肝脏病理结构的影响组ALB和CYP3A4的表达量显著升高(P0.05),与4w组相比,4t与1y组ALB和CYP3A4的表达量显著升高(P0.05),与4t组相比,1y组CK18、ALB和CYP3A4的表达量显著升高(P0.05)。结论:1移植UCMSCs可以改善急性肝损伤和肝纤维化模型大鼠的肝功能,并减轻急性肝损伤和肝纤维化模型大鼠肝脏组织病变。2经静脉移植的UCMSCs可以迁移并定居在受损肝脏组织;并且在肝脏组织定向分化为具有肝细胞特异标志物和功能蛋白的肝细胞,这可能是UCMSCs治疗肝损伤的作用途径之一。第二部分脐带间充质干细胞体外定向分化为肝细胞的实验研究目的:建立并优化体外诱导间充质干细胞定向分化为肝细胞的方法,并对诱导后的细胞进行肝细胞的特征和功能测定。方法:1取正常雄性SD大鼠和急性肝损伤模型大鼠,将肝脏灌流后手动匀浆,制备肝匀浆上清提取物(liver homogenate supernatant,LHS)和CCl4-LHS,并配制体外诱导培养基。LHS的应用浓度为100 mg/m L,CCl4-LHS的应用浓度为50 mg/m L。2实验分组取第3代UCMSCs,以1.2×105个/孔的细胞密度接种于25 cm2培养瓶中,培养1-2天,待细胞长至80%汇合,吸弃培养液,加入诱导培养基。实验组分为8组,分别为:(1)LHS对照组,(2)LHS-3d组,(3)LHS-5d组,(4)LHS-7d组,(5)CCl4-LHS对照组,(6)CCl4-LHS-3d组,(7)CCl4-LHS-5d组,(8)CCl4-LHS-7d组。对照组正常培养,LHS组加入LHS,CCl4-LHS组加入CCl4-LHS,于不同时间点3 d,5 d,7d进行处理,收集细胞及细胞上清液。3应用Western blot技术和Real time-PCR技术,研究诱导后细胞AFP、CK18、ALB、CYP450酶系蛋白和基因水平表达的变化。4应用HPLC/MS/MS测定CYP450酶代谢产物的方法,来评估CYP450酶系CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP3A4的代谢活性。1体外LHS和CCl4-LHS诱导UCMSCs对细胞形态的影响倒置显微镜下观察,对照组UCMSCs为均一的长梭形的成纤维样细胞,呈旋涡状排列生长,LHS诱导后,细胞两级收缩,胞体变短,长梭形细胞逐渐减少,3 d时观察可见大量异形细胞;5 d时观察可见梭形细胞继续减少,可见部分细胞呈三角形或多角形;诱导培养7d后,大多数细胞呈不规则形或类圆形。CCl4-LHS诱导后1 d,倒置显微镜下观察即可见细胞开始收缩,3 d时细胞呈圆形或椭圆形,5 d,7d细胞形态变化不大。2体外LHS和CCl4-LHS诱导UCMSCs对肝细胞相关蛋白表达的影响Western blot结果显示:与对照组相比,LHS和CCl4-LHS诱导不同时间组AFP、CK18、ALB、CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2C9、CYP 2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的表达均显著增强(P0.05),其中,LHS组AFP的表达量在诱导5 d时达到峰值,随后下降;CK18和ALB的表达量均随诱导时间延长而增加(P0.05),CYP450酶家族蛋白在5 d或7d表达量最大;CCl4-LHS组AFP的表达量在诱导3 d时达到峰值,随后下降;ALB的表达量均随诱导时间延长而增加,CK18和CYP450酶家族蛋白均在3 d表达量最大(P0.05)。与LHS-3d组相比,CCl4-LHS-3d组6个指标表达水平显著升高;4个指标表达水平显著降低;与LHS-5d组相比,CCl4-LHS-5d组2个指标表达水平显著升高,8个指标表达水平显著降低;与LHS-7d组相比,CCl4-LHS-7d组8个指标表达水平显著降低(P0.05)。3体外LHS和CCl4-LHS诱导UCMSCs对肝细胞相关基因表达的影响RT-PCR结果可见:与对照组相比,LHS和CCl4-LHS诱导不同时间组AFP、CK18、ALB、CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的表达均显著增强(P0.05),其中,两组AFP的表达量均在诱导3 d时达到峰值,ALB和CK18的表达量均随诱导时间延长而增加,LHS组CYP450酶家族中CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4的基因表达量在5 d时达到峰值,CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2E1的基因表达量在7d时最大(P0.05);CCl4-LHS组CYP450酶家族中CYP1A1/2、CYP2A6的表达量在5 d达最大,CYP2C9的表达量在3 d达结果:最大,CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的表达量在7d达峰(P0.05)。与LHS-3d组相比,CCl4-LHS-3d组9个指标的表达水平显著升高,1个指标表达水平显著降低;与LHS-5d组相比,CCl4-LHS-5d组4个指标的表达水平显著升高,5个指标的表达水平显著降低,1个指标的表达水平不变;与LHS-7d组相比,CCl4-LHS-7d组3个指标的表达水平显著升高,6个指标表达水平显著降低,1个指标的表达水平不变(P0.05)。4体外LHS和CCl4-LHS诱导UCMSCs对CYP450酶家族代谢活性的影响添加6种CYP450酶代谢底物后,检测结果显示:检测到5种代谢产物,分别为1,7-二甲基黄嘌呤,7-羟基香豆素,4-羟基甲苯磺丁脲,6-羟基氯唑沙宗,1-羟基咪达唑仑,说明诱导后的细胞具备CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4酶的活性,经过蛋白定量后的结果显示,与对照组相比,各组酶产物均显著升高(P0.05);LHS组CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4酶活性均在5d组最高;CCl4-LHS组CYP1A2、CYP2A6、CYP2E1和CYP3A4酶活性均在3d组最高;CYP2C9酶活性各组间无显著性差别(P0.05)。与LHS-3d组相比,CCl4-LHS-3d组3个指标的表达水平显著升高,1个指标表达水平显著降低;1个指标的表达水平不变;与LHS-5d组相比,CCl4-LHS-5d组3个指标的表达水平显著降低,2个指标的表达水平不变;与LHS-7d组相比,CCl4-LHS-7d组1个指标表达水平显著降低,4个指标的表达水平不变(P0.05)。5体外LHS和CCl4-LHS诱导UCMSCs对细胞合成分泌白蛋白和尿素的影响与对照组相比,LHS各诱导组分泌的ALB均显著增高,且随诱导时间增长分泌量升高(P0.05);与对照组相比,诱导组分泌的尿素均显著增高,且随诱导时间增长分泌量升高(P0.05)。与对照组相比,CCl4-LHS各诱导组分泌的ALB均显著增高,其中LHS-3d组分泌量最大,之后逐渐降低(P0.05);与对照组相比,CCl4-LHS各诱导组分泌的尿素均显著增高,其中LHS-3d组分泌量最大,之后逐渐降低(P0.05)。与LHS-3d组相比,CCl4-LHS-3d组ALB和尿素分泌水平均显著升高;与LHS-5d组相比,CCl4-LHS-5d组ALB分泌水平显著升高,尿素分泌水平显著降低;与LHS-7d组相比,CCl4-LHS-7d组ALB分泌水平不变,尿素分泌水平显著降低(P0.05)。结论:1体外正常肝组织和肝损伤微环境可诱导UCMSCs定向分化为具有肝细胞形态特征的细胞,其高表达肝细胞标志和功能蛋白及其基因,具备部分CYP450酶活性,能够分泌白蛋白和尿素。说明正常肝组织和肝损伤微环境均可诱导UCMSCs定向分化为具有部分肝细胞功能的细胞,这可能是UCMSCs改善肝功能的作用途径之一。2体外肝损伤微环境诱导UCMSCs相比于正常肝组织微环境,诱导效果相似,所需诱导浓度更低,诱导时间更短,因此具有更高的效率,提示肝损伤微环境更有利于UCMSCs向肝细胞的定向分化。第三部分LKB1/AMPK/HNF-4α信号通路在脐带间充质干细胞定向分化为肝细胞中的作用目的:研究LKB1/AMPK/HNF-4α信号通路在UCMSCs定向分化为肝细胞中的作用方法:1通过基因表达谱芯片实验筛选UCMSCs定向分化为肝细胞后变化的基因,并进行IPA分析,寻找关键基因上游相关信号通路。2实验分组基因表达谱芯片实验分为2组:对照组和LHS组,每组3个复孔,分别为C-1,C-2,C-3,LHS-1,LHS-2,LHS-3。信号通路实验分为6组:(1)对照组(2)CCl4-LHS-3d组(3)AMPK激活剂AICAR组(1 m M)(4)AMPK抑制剂Dorsomorphin 2 HCl(DM)组(10μM)(5)CCl4-LHS+AICAR组(6)CCl4-LHS+DM组。3采用Western blot技术和Real time-PCR技术,检测诱导后LKB1、AMPK、HNF-4α等蛋白和基因水平的变化;采用Real time-PCR技术观察HNF-4α抑制剂BI6015对诱导分化的影响;采用Western blot技术观察AMPK激活剂AICAR和拮抗剂Dorsomorphin 2 HCl对诱导分化的影响。1芯片数据的质控通过做Signal Histogram图、Relative Signal Box Plot图、Pearson's Correlation(signal)图和PCA图,对基因谱芯片数据进行质控,结果显示数据质控良好。2芯片数据分析结果1)有显著差异表现的基因数目根据实验设计的要求,基因表现有显著差异的筛选标准为必须符合|FC|要大于2,且P值要小于0.05。结果显示与对照组相比,LHS组上调基因数为1167,下调基因数为1337。结果通过火山图,散点图,聚类图直观展示。2)芯片数据分析结果的Pathway分析根据筛选出的差异基因,进行Pathway富集分析。根据KEGG与BIOCARTA中所有pathway的基因信息,将差异基因进行富集分析,根据P值排序后,我们选取前十位的加以展示。3)芯片数据分析结果的信号通路柱状图信号通路柱状图展示了差异基因在经典信号通路中的富集情况。差异基因所调控的经典通路由IPA所收集归纳的800条信号、代谢通路所总结;所有的信号通路使用-Log P进行排序。4)AMPK相关信号通路图信号通路图展示了实验数据对信号通路的信号传递的影响。在信号通路图中给出了各种分子的信号传递过程和差异基因的上下调情况,通过分子激活预测,对其他基因进行了激活抑制预测。结果展示了与AMPK相关信号通路的各种分子的传递过程。5)差异基因的上游调控分析上游调控因子分析表展示了本实验中所有的差异基因的上游调控因子。上游调控因子可以是任何能够影响基因表达的分子,它覆盖了全部的分子类型,包括转录因子,细胞活素,小RNA,受体,激酶,化学分子和药物。IPA使用了Activation z-score算法,对上游调控子的激活或者抑制进行预测,并降低了由于随机数据造成的显著预测。结果显示:肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor-4α;HNF-4α)被预测为激活。6)HNF-4α上游调控子网络图结果:上游调控子网络图展示了上游调控因子和与其直接相关的并存在于数据集中的下游分子之间的相互作用关系。3体外LHS和CCl4-LHS诱导对UCMSCs的HNF-4α基因和蛋白水平表达的影响RT-PCR结果可见:与LHS对照组相比,LHS诱导不同时间组HNF-4α的表达均显著增强(P0.05),且表达量均随诱导时间延长而增加,7d组表达水平达峰值;与CCl4-LHS对照组相比,CCl4-LHS诱导不同时间组HNF-4α的表达均显著增强,其中,3d与5d组表达水平无显著性差异,7d组与3d、5d组相比,表达水平显著升高(P0.05)。与LHS组各时间点相比,CCl4-LHS组HNF-4α的表达均显著增强(P0.05)。Western blot结果显示:与LHS对照组相比,LHS诱导不同时间组HNF-4α的表达均显著增强(P0.05),且表达量均随诱导时间延长而增加,7d表达量最大(P0.05);与CCl4-LHS对照组相比,CCl4-LHS诱导不同时间组HNF-4α的表达均显著增强,其中,表达量在诱导3d时达到峰值,随后下降(P0.05)。与LHS组各时间点相比,CCl4-LHS组HNF-4α的表达均显著增强(P0.05)。4体外BI6015对CCl4-LHS诱导UCMSCs定向分化的影响RT-PCR结果可见:与对照组相比,CCl4-LHS-3d组HNF-4α、AFP、CK18、ALB和CYP3A4的表达均显著增强(P0.05),BI6015组HNF-4α、AFP、CK18、ALB和CYP3A4的表达均显著降低(P0.05),BI6015+CCl4-LHS组HNF-4α、AFP、CYP3A4的表达均显著降低(P0.05),ALB表达显著升高(P0.05);与CCl4-LHS-3d组相比,BI6015组和BI6015+CCl4-LHS组HNF-4α、AFP、CK18、ALB和CYP3A4的表达均显著降低(P0.05);与BI6015组相比,BI6015+CCl4-LHS组AFP、CK18和ALB表达均显著升高(P0.05)。5体外CCl4-LHS诱导对UCMSCs的AMPK和LBK1基因表达的影响RT-PCR结果可见:与对照组相比,CCl4-LHS-3d组AMPKα1、AMPKα2和LKB1的表达均显著增强(P0.05)。Western blot结果显示:与对照组相比,CCl4-LHS-3d组LKB1和AMPK的表达水平无显著性变化,p-LKB1(S428)、p-LKB1(T189)、p-AMPK的表达水平均显著降低(P0.05)。6体外AICAR和DM对CCl4-LHS诱导UCMSCs定向分化的影响Western blot结果显示:HNF-4α表达水平,与对照组相比,CCl4-LHS-3d组、DM组和CCl4-LHS+DM组显著升高,AICAR组和CCl4-LHS+AICAR组显著降低(P0.05);与CCl4-LHS-3d相比,AICAR组和CCl4-LHS+AICAR组显著降低,CCl4-LHS+DM组显著升高(P0.05);与AICAR组相比,DM组和CCl4-LHS+DM组显著升高(P0.05);与DM组相比,CCl4-LHS+AICAR组显著降低,CCl4-LHS+DM组显著升高(P0.05)。AMPK表达水平各组间无显著性差异。p-AMPK表达水平,与对照组相比,CCl4-LHS-3d组、DM组和CCl4-LHS+DM组显著降低,AICAR组和CCl4-LHS+AICAR组显著升高(P0.05);与CCl4-LHS-3d相比,AICAR组和CCl4-LHS+AICAR组显著升高,CCl4-LHS+DM组显著降低(P0.05);与AICAR组相比,DM组和CCl4-LHS+DM组显著降低(P0.05),与DM组相比,CCl4-LHS+AICAR组显著升高,CCl4-LHS+DM组显著降低(P0.05)。7体外CCl4-LHS诱导对UCMSCs的PI3K和AKT基因表达的影响RT-PCR结果可见:与对照组相比,CCl4-LHS-3d组PI3K的表达显著增强(P0.05)。Western blot结果显示:与对照组相比,CCl4-LHS-3d组PI3K和p-AKT表达均显著升高(P0.05)。结论:1体外正常肝组织和肝损伤微环境可通过上调HNF-4α的基因和蛋白表达水平,诱导UCMSCs定向分化为肝细胞,且肝损伤微环境上调HNF-4α的基因和蛋白水平高于正常肝组织微环境诱导结果;抑制HNF-4α基因表达可抑制肝细胞相关标志蛋白基因的表达,提示HNF-4α为启动UCMSCs向肝细胞定向分化的关键基因之一,肝损伤微环境对HNF-4α表达的影响大于正常肝组织微环境。2肝损伤微环境可通过降低LBK1和AMPK磷酸化蛋白表达诱导UCMSCs向肝细胞定向分化;抑制磷酸化AMPK蛋白表达可使HNF-4α表达升高,增加磷酸化AMPK蛋白表达可使HNF-4α表达降低,提示AMPK磷酸化蛋白表达与HNF-4α表达呈负相关,LBK1/AMPK/HNF-4α信号通路在肝损伤微环境诱导的UCMSCs向肝细胞定向分化中发挥重要作用。综上所述,本实验以肝损伤模型大鼠为治疗对象,研究UCMSCs对其治疗效果及其分化机制;以体外正常肝组织和肝损伤微环境诱导UCMSCs定向分化为肝细胞为平台研究其分化的分子机制。研究发现经静脉移植UCMSCs对急性肝损伤和肝纤维化模型大鼠的治疗作用明显,移植的UCMSCs可以迁移并定居在受损肝脏组织,并且在肝脏组织定向分化为具有肝细胞特异标志物的肝细胞,提示其为UCMSCs治疗肝损伤类疾病发挥作用的途径之一。正常肝组织和肝损伤微环境可在体外诱导UCMSCs定向分化为具有肝细胞形态特征的细胞,其高表达肝细胞的标志和功能蛋白及基因,具备部分CYP450酶活性,能够分泌白蛋白和尿素,说明此诱导方法是一种可以诱导UCMSCs定向分化为肝细胞的方法。肝组织微环境作用下UCMSCs分化而来的肝细胞具有部分肝细胞功能,这可能是UCMSCs改善肝功能的作用途径之一。进一步研究发现UCMSCs定向分化为肝细胞后HNF-4α基因和蛋白水平显著升高,LBK1和AMPK磷酸化蛋白表达水平显著降低,说明LKB1/AMPK/HNF-4α信号通路在UCMSCs定向分化为肝细胞的过程中发挥重要作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575

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