Cdk5通路在脑缺血再灌注损伤中的作用及神经调节素1β抗凋亡机制研究

发布时间：2017-12-22 22:04

  本文关键词：Cdk5通路在脑缺血再灌注损伤中的作用及神经调节素1β抗凋亡机制研究　出处：《青岛大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:在前期研究工作基础上,研究大鼠脑缺血2h再灌注22h后,Cdk5信号通路的表达情况;探讨NRG1β对Cdk5通路的影响、能否通过Cdk5通路抑制神经细胞凋亡,及其具体作用机制和关键环节,为将来应用NRG1β防治缺血性脑血管病提供理论依据。方法:(1)成年健康雄性Wistar大鼠360只,应用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线建立大脑中动脉缺血再灌注(MCAO/R)模型,随机数字表法将大鼠分为假手术(Sham)组55只、模型(MCAO/R)组、治疗(NRG1β)组、抑制剂+治疗(Ros+NRG1β)组和抑制剂(Ros)组,每组动物55只。(2)Sham组线栓不入颅、不建立MCAO模型,2h后经ECA残端向ICA内注射0.1mol/L PBS 5μl;MCAO/R组建立MCAO/R模型后2h拔除线栓,同步经ECA残端向ICA内注射0.1mol/L PBS 5μl;NRG1β组动物缺血2h后拔除线栓,同时经ECA残端向ICA内微量注射8%NRG1β5μl(2μg/kg);Ros+NRG1β组在插线前经ECA残端向ICA注射Roscovine 5μl,缺血2h后拔除线栓实现再灌注,同时给予8%NRG1β5μl;Ros组注射Roscovine同Ros+NRG1β组,但缺血2h后拔除线栓时同步给予0.1mol/l PBS 5μl。(3)治疗后(或再灌注后)22h应用改良神经功能缺损评分(m NSS评分)测试动物神经功能,干湿重法测量大鼠脑组织含水量,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色测量脑梗死体积,HE染色和甲苯胺蓝(Nissl)染色观察神经细胞形态结构,透射电镜(TEM)观察神经元超微结构,原位TUNEL法和流式细胞学技术(FCM)检测细胞凋亡,免疫组化(IHC)和Western Blot检测Calpain1、p35/p25、Cdk5、p-Tau蛋白在神经元内的定位定量表达。结果:(1)NRG1β对大鼠神经行为功能的影响:Sham组无神经行为功能缺损表现,m NSS评分0分;MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组大鼠存在不同程度神经行为功能缺损的表现,m NSS评分较Sham组显著升高(P0.05),NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组大鼠神经行为功能缺损较MCAO/R组均有改善,m NSS评分较MCAO/R组有不同程度下降,差异有统计学意义(P0.05);Ros+NRG1β组大鼠m NSS评分最低,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。(2)NRG1β对大鼠脑组织含水量的影响:MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组大鼠脑组织含水量显著高于Sham组(P0.05);NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组含水量较MCAO/R组均有下降(P0.05);NRG1β组与Ros组比较脑组织含水量无明显差异(P0.05);Ros+NRG1β组较MCAO/R组、NRG1β组、Ros组脑组织含水量显著降低(P0.05)。(3)NRG1β对大鼠脑梗死体积的影响:Sham组未见脑梗死病灶;MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组与Sham组相比,脑梗死体积不同程度地增大,差异显著(P0.05);MCAO/R组梗死体积较NRG1β组、Ros组及Ros+NRG1β组均明显增大,差异有统计学意义(P0.05);NRG1β组与Ros+NRG1β组脑梗死体积较Ros组显著减小(P0.05),而Ros+NRG1β组脑梗死体积最小,与其他各组比较均有显著性差异(P0.05)。(4)NRG1β对神经细胞形态结构的影响:HE染色和Nissl染色均显示:Sham组形态结构正常、未见明显变性坏死的神经元细胞,变性细胞指数(DCI)低;MCAO/R组、NRG1β组、Ros组、Ros+NRG1β组与Sham组相比,DCI明显升高,出现不同程度的神经元细胞损伤情况,如细胞排列紊乱、固缩、胞膜破裂,胞核消失,空泡样变等,差异有统计学意义(P0.05);NRG1β组、Ros组、Ros+NRG1β组DCI较MCAO/R组有不同程度地下降,其形态结构、神经元细胞损伤介于Sham组与MCAO/R组之间,差异有显著性(P0.05);Ros+NRG1β组较NRG1β组、Ros组DCI均有下降,变性坏死的神经元细胞更为减少,细胞损伤程度减轻,差异有统计学意义(P0.05)。(5)NRG1β对神经元超微结构的影响:Sham组神经元超微结构正常,细胞核大而圆、染色质分布均匀,细胞器丰富,细胞膜、核膜完整,神经元轴突正常、微管正常,偶见凋亡的神经细胞;MCAO/R组与Sham组相比,神经元损伤严重,细胞固缩,细胞器数量明显降低甚至消失、空泡变性,形成凋亡小体、神经细胞凋亡显著;NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组神经元损伤介于Sham组和MCAO/R组之间;NRG1β组与Ros组神经元超微结构接近;Ros+NRG1β组损伤更轻、神经细胞凋亡较NRG1β组及Ros组亦有改善,部分出现空泡,细胞结构较正常完整、边缘清楚,细胞器损伤亦减轻,细胞连接较紧密。(6)NRG1β对细胞凋亡的影响:(1)TUNEL法显示:Sham组顶叶皮层神经元细胞浅染为淡蓝色,绝大部分细胞结构完整、排列整齐,胞膜光滑,胞浆丰富,细胞核清晰可见,细胞间质无水肿等;偶见细胞凋亡;MCAO/R组可见大量神经细胞凋亡,细胞排列紊乱、固缩、胞膜皱缩、细胞质被染成棕色,胞核被染成褐色或棕褐色,或固缩、碎裂,甚至崩解、形成空泡;NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组神经元细胞形态改善、排列较为整齐,结构相对完整,部分神经细胞核固缩、碎裂、形成空泡;Ros+NRG1β组,较NRG1β组、Ros组明显改善,变性坏死神经元减少。(2)FCM法与TUNEL法均显示:MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组与Sham组相比,早期凋亡细胞指数(EACI)、凋亡细胞指数(ACI)均显著升高(P0.05)。Ros+NRG1β组、NRG1β组、Ros组与MCAO/R组相比,EACI、ACI不同水平下降,差异有统计学意义(P0.05)。Ros+NRG1β组与NRG1β组、Ros组比较,EACI、ACI均有下降,差异有显著性(P0.05)。(7)NRG1β对蛋白定位表达的影响:IHC染色显示:(1)Calpain 1:MCAO/R组较Sham组,阳性细胞数指数(PCI)显著升高(P0.05);NRG1β组、Ros+NRG1β组,PCI较MCAO/R组明显降低(P0.05),而两两比较无统计学意义(P0.05);Ros组Calpain 1表达较MCAO/R组无显著性差异(P0.05),与NRG1β组、Ros+NRG1β组差异明显(P0.05)。(2)Cdk5:与Sham组比较,MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组PCI明显升高,差异有显著性(P0.05);而MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组PCI之间两两比较,差异无显著性(P0.05)。(3)p35/p25:MCAO/R组、Ros组p35/p25表达较Sham组明显增强,PCI显著升高,(P0.05),但两两比较无显著差异(P0.05);NRG1β组、Ros+NRG1β组p35/p25表达较MCAO/R组、Ros组明显减少(P0.05),而NRG1β组与Ros+NRG1β组比较无统计学意义(P0.05)。(4)p-Tau:MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组,与Sham组比较,蛋白表达明显增加,PCI显著升高(P0.05);NRG1β组、Ros组、Ros+NRG1β组,PCI较MCAO/R组不同程度下降,差异有统计学意义(P0.05);Ros+NRG1β组,与NRG1β组和Ros组比较PCI降低,差异显著(P0.05);与Ros组比较,NRG1β组p-Tau表达较低,PCI下降,差异有统计学意义(P0.05)。(8)NRG1β对蛋白定量表达的影响:Western blot显示:(1)Calpain 1:MCAO/R组较Sham组,Calpain 1相对蛋白含量明显增加(P0.05);NRG1β组、Ros+NRG1β组,相对蛋白含量较MCAO/R组明显降低(P0.05),而其两两比较无统计学意义(P0.05);Ros组Calpain 1表达较MCAO/R组无显著性差异(P0.05),与NRG1β组、Ros+NRG1β组比较则均有统计学意义(P0.05)。(2)Cdk5:与Sham组比较,MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组Cdk5相对蛋白含量明显升高(P0.05);而MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组间两两比较,差异无显著性(P0.05)。(3)p35/p25:MCAO/R组、Ros组较Sham组p35/p25蛋白表达明显增加,相对蛋白含量均显著升高(P0.05),但MCAO/R组与Ros组蛋白表达无差异(P0.05);NRG1β组、Ros+NRG1β组蛋白表达较MCAO/R组、Ros组明显减少(P0.05),而NRG1β组与Ros+NRG1β组蛋白相对含量比较无统计学意义(P0.05)。(4)p-Tau:MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组,与Sham组比较p-Tau蛋白表达明显增加、相对蛋白含量显著升高(P0.05);NRG1β组、Ros组、Ros+NRG1β组,p-Tau表达较MCAO/R组不同程度下降,差异有统计学意义(P0.05);Ros+NRG1β组p-Tau相对蛋白含量最低,与NRG1β组和Ros组比较,差异均有统计学意义(P0.05);与Ros组比较,NRG1β组p-Tau蛋白表达较低,相对蛋白含量少,差异有统计学意义(P0.05)。结论:脑缺血再灌注损伤发生后,Cdk5通路过度激活,导致神经元细胞凋亡;其特异性抑制剂Roscovitine可以阻断Cdk5通路诱导凋亡的作用,有利于脑缺血再灌注损伤后神经功能恢复。神经调节素1β可以抑制Cdk5通路中Calpain1、p35/p25、p-Tau的表达,减少神经元凋亡,缩小脑梗死体积,改善神经行为功能,在脑缺血再灌注损伤后发挥神经保护作用。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743

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本文编号：1321204