2型腓骨肌萎缩症家系新致病基因的筛查及发病机制研究

发布时间：2017-12-23 05:02

  本文关键词：2型腓骨肌萎缩症家系新致病基因的筛查及发病机制研究　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：腓骨肌萎缩症又称为CMT,是最常见的遗传性神经系统疾病,发病率约为1/2500。CMT在幼年及成年都可发病,患者常伴有四肢无力、四肢远端肌肉进行性萎缩、足部骨骼畸形、轻度感觉受累等症状。CMT通常不致命,但由于患者运动功能受损,生活质量受到严重影响。根据患者的病理特点及运动神经元传导速率,CMT可分为脱髓鞘型(CMT1,MNCV38 m/s)、轴索型(CMT2,MNCV38 m/s)和中间型(ICMT,25MNCV45 m/s)三种类型。CMT具有明显的遗传异质性和临床异质性特点。到目前为止,已发现80多个基因的突变与CMT的发生相关,其中超过半数的致病基因都是在2009年外显子组测序技术被应用后发现的。至今,超过90%的CMT1患者通过基因诊查明了致病基因,然而CMT2患者中却仍有25-43%没有得到明确的基因诊断,即使在最新的临床病例中,也仍有很多CMT2患者未能检出致病基因。筛查CMT2新的致病基因,不仅有助于提高CMT2患者的检出率,还有助于CMT2发病机制地阐明,帮助CMT2患者采取更准确、有效的治疗措施。前期,我们实验室在山东省发现了一个遗传病家系,该家系连续三代均有发病患者。遗传系谱图分析,该家系疾病为常染色体显性遗传病。我们对该家系部分发病患者进行了全面的临床检查,检查发现该家系患者四肢远端肌肉萎缩,出现诸如爪形手、鹤形腿、高弓足、槌状趾等CMT病症。电生理检查发现,患者正中神经和尺神经的运动神经元传导速率轻度减慢(36-47 m/s),而各神经的复合动作电位明显降低;患者腓肠神经病理检查发现,有髓神经纤维轴索发生明显萎缩,出现空泡样病变,少数髓鞘出现分层结构。经临床诊断,该家系患者被确诊为CMT2型。为明确该CMT2家系的发病原因,我们对该家系患者进行了CMT2常见致病基因的筛查,未发现常见致病基因发生突变。为寻找该家系遗传病的致病基因,我们利用外显子组捕获与二代测序技术,对患者基因组进行了突变筛查,筛查获得77个突变基因,共82个突变位点。然后,我们对山东CMT2家系成员基因组内的这些位点一一进行了Sanger测序验证,并进行了基因型与表型共分离分析,结果发现患者基因组中AFAP-120基因的第1621位发生错义突变(c.1621CT),其编码蛋白第541位非极性脯氨酸被极性丝氨酸替代。在正常人群中对AFAP-120基因突变进行筛查,未发现相关突变。为检测AFAP-120c.1621CT突变是否具有广泛的普适性,在其他CMT2患者中也同样存在,我们先后收集了148例CMT2患者基因组样品,这些样品均未发现常见CMT2致病基因的突变。对这些患者AFAP-120基因所有的外显子进行测序分析,遗憾的是并未发现c.1621CT突变,但筛查到一个c.1738AG(p.N580D)SNP位点。人AFAP-120基因定位于4p16.1,其编码蛋白是一个由814个氨基酸构成的微丝结合蛋白。AFAP-120蛋白是AFAP-110的剪接异构体,在结构上仅比AFAP-110多一个富含脯氨酸的NINS结构域。我们在CMT2患者中筛查获得的点突变P541S即位于NINS结构域内。AFAP-110在组织中广泛表达,而AFAP-120仅在神经系统中特异表达。至今,没有关于AFAP-120突变导致CMT2发生的文献报道,对AFAP-120功能,尤其是NINS片段的功能也知之甚少。序列比对分析,人AFAP-120第541位脯氨酸在各物种中高度保守,提示该位点氨基酸在进化中可能发挥不可替代的功能。利用MutationTaster、PolyPhen-2等软件对AFAP-120 c.1621CT(p.P541S)突变位点的致病性进行分析,结果显示该位点突变具有很强的致病性(PolyPhen-2 HumVar model预测得分高达0.996)。为进一步明确AFAP-120错义突变c.1621CT(p.P541S)与CMT2发生之间的因果关系,并探索该突变导致CMT2发生的具体机制,我们构建了AFAP-120P542S转基因小鼠模型,将小鼠AFAP-120蛋白对应于患者AFAP-120突变位点的脯氨酸替换为丝氨酸。通过后续繁育与基因型鉴定,成功获得点突变杂合及纯合小鼠,并将杂合小鼠交配,繁殖获得了不同基因型的同窝小鼠,用于后续行为学及神经病理学实验。对转基因小鼠进行滚轴、热板、足迹等行为学评价,发现出生11个月后,雌性纯合AFAP-120 P542S小鼠四肢感觉能力较野生型小鼠减弱;雄性纯合AFAP-120 P542S小鼠出现步态失调。对小鼠外周神经进行了病理学实验,发现AFAP-120发生突变后,部分杂合及纯合小鼠,其腓浅神经有髓神经纤维的轴索萎缩,出现大量空泡样结构,平均横切面积约减少30%;少数轴突伴有髓鞘病变,出现低片层结构。部分杂合及纯合小鼠,其腓浅神经有髓神经纤维畸形,髓鞘增生,增厚或形成多个独立而聚集的“龙卷风状”结构,平均厚度分别增加约0.080μm、0.167μm;有髓神经纤维轴索不规则萎缩,平均横切面积分别减少0.520μm2、4.429μm2;无髓神经纤维轴索萎缩,甚至消失;轴索中部分线粒体膨大,嵴消失,出现空泡状改变。为探索AFAP-120 c.1621CT(p.P541S)导致CMT2发生的机制,研究AFAP-120及NINS结构域的功能,我们在分子和细胞水平进行了实验。利用免疫共沉淀的方法外源检测了AFAP-120与其结合蛋白相互作用的变化,结果发现AFAP-120(P541S)结合β-actin蛋白的量增加,约为AFAP-120(WT)的1.5倍;利用免疫荧光实验检测了AFAP-120(P541S)对细胞微丝骨架的影响,结果显示在SH-SY5Y细胞内AFAP-120(P541S)突变蛋白与微丝缠绕形成斑点状结构。微丝是细胞骨架的重要组成,微丝骨架重塑不仅影响神经元及雪旺氏细胞的形态,而且通过调节髓鞘蛋白的表达影响髓鞘的形成。作为一个微丝结合蛋白,AFAP-120突变后可能通过改变微丝骨架的结构导致CMT2的发生。总结,我们发现了一个新的CMT2亚型及其致病基因AFAP-120 c.1621CT(p.P541S);构建了AFAP-120P542S转基因小鼠模型,发现转基因小鼠轴索发生了与CMT2患者相同的病变;对AFAP-120(P541S)突变导致CMT2的分子机制进行了探索,发现AFAP-120蛋白NINS结构域发生P541S点突变后,结合的微丝蛋白增多,微丝骨架结构发生改变。本文研究不仅为山东CMT2家系潜在患者的提前诊断、及时诊治以及该家系成员的遗传咨询和产前诊断提供了依据,而且为相关CMT2患者的基因诊断提供了参考。此外,本文对CMT2新治疗药物的开发以及AFAP-120蛋白功能的研究也有借鉴意义。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R746.4

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本文编号：1322499