3D生物支架材料对干细胞细胞活性及成骨分化的影响和相关通路研究

发布时间：2017-12-24 04:21

  本文关键词：3D生物支架材料对干细胞细胞活性及成骨分化的影响和相关通路研究　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：研究背景:骨组织工程现已被广泛用于治疗骨缺损性疾病,如骨折、骨髓炎,骨肉瘤等。骨组织工程在口腔医学领域的应用,主要包括颅颌面的骨缺损,种植技术等。骨组织工程主要包括三个基本要素:干细胞,生长因子和支架材料。其中,生物支架材料作为原始自体骨和异体骨的替代品,已经被大量投入临床应用。理想型的生物支架材料一般具备四大要素:一、生物相容性:这种性质主要由材料本身的物理化学特性决定,尤其是支架材料表面的亲和力。二、生物降解性:理想的骨性支架材料的降解速度应和骨形成的速度一致。三、多孔性:与松质骨类似,支架材料的多孔性可促进细胞渗透,营养扩散和骨增长。四、机械强度:生物支架材料的机械强度包括韧性,杨氏模量,抗拉强度,抗压强度,剪切模量和疲劳强度等。理想的材料机械强度是模拟宿主骨组织本身的机械强度,并存在个体差异。随着3D打印技术和纳米科技的发展,将四种要素最优化的理想型生物支架材料的研发具有广阔的应用前景。氧化石墨烯作为一种新型的纳米材料已被广泛应用于生物医学研究的各个领域,如质谱仪、药物传递及传感器等。前期的研究发现,氧化石墨烯可以包被在多种生物支架材料表面,像人工合成聚合物、生物陶瓷及玻璃等,对细胞的增殖和成骨分化具有促进作用。但将氧化石墨烯与钛金属类生物支架材料结合的相关研究有限。并且,基于口腔种植技术的生物学基础,研究此种复合生物材料对人牙周膜干细胞(PDLSCs)的生物学活性和成骨分化的影响,将会促进口腔种植体的优化和提高种植技术的成功率。基于以上性质的另一种聚合物类支架材料,胶原糖胺聚糖生物支架材料(CG-GAG)获得越来越广泛的关注。多孔结构的胶原糖胺聚糖生物支架已被用于各种组织工程,在体内作为皮肤、外周神经、软骨和骨的再生支架材料以及体外作为3D微环境探讨细胞行为和细胞与细胞外基质的相互作用。胶原糖胺聚糖支架具有孔微结构,同时可以阻止细胞介导的收缩和瘢痕组织合成,并且能够支持细胞附着,细胞增殖,有效的代谢物转运和功能性细胞外基质的合成。我们实验室前期研究表明,胶原糖胺聚糖支架与聚乳酸-羟基乙酸共聚物相比,能促进人间充质干细胞(hMSCs)矿化。但细胞接种后的胶原糖胺聚糖支架在培养过程中明显收缩。为进一步优化CG-GAG支架材料,合成了矿化胶原糖胺聚糖(MC-GAG)支架材料。使用共沉淀方法诱导纳米级磷酸钙晶体(nCaP)与胶原和糖胺聚糖沉淀在胶原原纤维上形成纳米颗粒矿化内容物。与单独的CG-GAG支架材料相比,MC-GAG支架材料的收缩率略有降低。磷酸钙沉积到胶原支架主要可提供两种促进成骨因素:增加支架的机械强度和Ca、P离子选择性洗脱到细胞培养液中。用于诱导骨形成的最常见的生长因子家族之一是骨形态蛋白(BMPs)家族。BMPs在细胞内以二聚化的前体蛋白形式存在。在二聚化时,前体蛋白在共有Arg-x-x-Arg位点切割,产生分泌的羧基末端成熟二聚体。从细胞分泌后,BMP二聚体通过结合BMP受体(BMPR)复合物激活细胞内的反应。BMP受体分为两型,Ⅰ型BMP受体包括ALK1、ALK2(ActR-1)、ALK3(BMPR-IA)和 ALK6(BMPR-IB);Ⅱ 型 BMP 受体包括BMPR-Ⅱ、活化的ActR-Ⅱ和AcR-ⅡB。不同的细胞类型,BMP受体表型发挥的作用也不同。根据BMPR寡聚化的方法,可能发生典型或非典型途径的活化。在典型的BMPR通路,受体Smads被招集和磷酸化。磷酸化受体Smads与co-Smad(Smad4)结合并转移到细胞核以激活各种相关基因的转录。在非典型途径中,有ERK、p38 MAPK和JNK通路的激活发生。ERK和p38 MAPK都具有靶向受体Smads用于蛋白酶体降解的能力。我们实验室前期研究外源BMP-2刺激作用于胶原糖胺聚糖支架材料(CG-GAG)和矿化的胶原糖胺聚糖支架材料(MC-GAG)对人间充质干细胞hMSCs成骨分化的影响。有趣的是,数据显示MC-GAG支架不受外源添加BMP-2生长因子的影响。虽然添加BMP-2导致hMSCs碱性磷酸酶表达的适度增加,但在其他成骨基因或矿化的表达中没有统计学上的显著差异。进一步研究发现,典型的BMP受体信号通路中的Smads(Smadl/5)分子在接受或不接受BMP-2刺激的情况下,在MC-GAG支架材料中始终处于磷酸化的激活状态。与此相反,在CG-GAG支架中,只有依赖于外源性的BMP-2刺激,Smadl/5分子才能磷酸化而被激活。同时,在检查三个非典型BMP受体信号通路分子时,只有ERK1/2信号通路在CG-GAG和MC-GAG支架材料中存在差异。在CG-GAG支架中,与MC-GAG支架材料相比,发现更大量的磷酸化的ERK1/2,特别是在早期的时间点。在第14天和第24天,CG-GAG和MC-GAG支架材料受到BMP-2刺激后均降低了磷酸化ERK1/2的表达。实验目的:研究氧化石墨烯钠钛板对人牙周膜干细胞的细胞活性和成骨分化的影响。研究胶原糖胺聚糖和矿化胶原糖胺聚糖支架材料对人间充质干细胞的细胞活性和成骨分化的影响。并进一步明确胶原糖胺聚糖支架材料中间充质干细胞成骨分化的BMP受体介导的相关信号通路研究。实验方法:第一部分实验:通过自组装技术合成氧化石墨烯包被的NaOH处理后的钛板(GO-Ti),通过扫描电镜,拉曼光谱和原子力显微镜检测GO-Ti的物理性能。然后将人牙周膜干细胞接种到氧化石墨烯钠钛板支架材料表面,培养1、3、7、10和14天后收集细胞。通过扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察细胞形态,MTT检测细胞增殖,ALP试剂盒检测碱性磷酸酶活性,Western blot检测BSP、RUNX2和OCN的蛋白表达及RT-PCR检测成骨相关基因的表达。第二部分实验:胶原糖胺聚糖和矿化胶原糖胺聚糖支架材料交联后,通过扫描电镜和EDX能谱分析材料本身机械性能和孔径大小。在CG-GAG和MC-GAG两种支架材料中接种人间充质干细胞hMSCs后培养3天、14天、28天和56天,收集细胞。Micro-CT检测hMSCs的矿物质沉积,HE染色观察hMSCs的形态和分布,RT-PCR检测成骨相关基因如ALP、OCN、RUNX2和COL-Ⅰ的表达。第三部分实验:主要研究在胶原糖胺聚糖支架材料中调节hMSCs成骨分化的BMP受体介导的信号通路。第一节,研究BMP受体通路抑制剂对人间充质干细胞的毒性,特异性和成骨分化的影响。在hMSCs的细胞矿化诱导液中加入不同浓度梯度的BMP受体信号通路抑制剂,光学显微镜下观察细胞形态,茜素红染色观察细胞矿化,Western blot检测特异性通路蛋白的表达和对其他信号通路的作用。第二节实验研究在矿化胶原糖胺聚糖支架材料中特异性阻断BMPR介导的Smad和ERK信号通路对人间充质干细胞成骨分化的影响。接种人间充质干细胞后分别加入DMH1(Smad通路抑制剂)和PD98059(ERK通路抑制剂)50uM培养3天、14天、28天和56天后收集细胞。RT-PCR检测成骨相关基因ALP、RUNX2和BSPⅡ的表达;WST-1检测hMSCs的细胞活性;Micro-CT检测hMSCs的成骨分化和矿物质沉积;HE和茜素红染色检测hMSCs的细胞形态和矿化;Western blot检测信号通路Smadl/5、ERK、JNK、p38和AKT磷酸化的蛋白和总蛋白的表达以及RUNX2的蛋白表达。实验结果:第一部分主要研究氧化石墨烯钠钛板(GO-Ti)对人牙周膜干细胞的细胞活性和成骨分化的影响。拉曼和原子力数据都显示氧化石墨烯钠钛板表面的氧化石墨烯的纯度优良。扫描电镜结果显示对照组钠钛板基板(Na-Ti)表面呈疏松多孔状,氧化石墨烯在钠钛板表面呈单层片状分布。MTT结果显示GO-Ti与基板对照组Na-Ti相比,促进了人牙周膜干细胞的增殖活性,证明GO-Ti材料本身具有良好的生物相容性。进一步观察GO-Ti表面人牙周膜干细胞的细胞形态,细胞伸展良好,细胞间多建立细胞连接并与底板间建立了突触连接。细胞形态变化,GO-Ti表面的细胞形态较Na-Ti略短粗,细胞分布密集且表达更多的F-肌动蛋白。结合RT-PCR,Western blot和碱性磷酸酶活性结果,GO-Ti促进了成骨相关基因ALP、BSP、COL-Ⅰ、RUNX2和OCNmRNA的表达,提高了 BSP、RUNX2和OCN蛋白的表达和碱性磷酸酶的活性。第二部分主要研究了胶原糖胺聚糖和矿化胶原糖胺聚糖支架材料的基本性能包括孔径大小和胶原支架形态分布以及对hMSCs的细胞活性和成骨分化的作用。MC-GAG在CG-GAG支架材料的基础上,通过纳米颗粒技术渗入磷酸钙颗粒,使支架材料本身的性能更贴近于自然的骨组织结构。MC-GAG与CG-GAG支架材料相比,Micro-CT显示,MC-GAG中本身的矿化程度明显高于CG-GAG,并且接种hMSCs后培养4周和8周后,两种材料的矿化程度均增高。矿化物质在MC-GAG支架材料中均匀分布,而在CG-GAG中分布集中在材料的边缘。RT-PCR检测成骨分化相关基因,hMSCs的ALP、OCN和RUNX2 mRNA在MC-GAG中的表达量均显著高于CG-GAG。证明MC-GAG支架材料能更好的促进hMSCs成骨分化和矿物盐沉积,在骨组织工程中有更广阔的应用前景。第三部分,我们比较了几种BMP受体信号通路抑制剂对hMSCs的细胞毒性,信号通路特异性,最适浓度和对其他通路的作用。比较选择出DMH1 50uM用于抑制典型BMP受体Smads信号通路和PD98059 50uM用于抑制非典型BMP受体信号通路中的ERK信号通路。为进一步研究CG-GAG和MC-GAG中hMSCs分化介导的信号通路实验做准备。将hMSCs接种到CG-GAG和MC-GAG支架材料中,分别加入DMH1和PD98059抑制剂后培养3天、14天、24天和56天后收集细胞。Western blot结果显示DMH1抑制了 P-Smadl/5的表达,对其他信号通路P-ERK、P-JNK、P-p38和P-JNK的表达无抑制作用。并且DMH1抑制了 CG-GAG和MC-GAG支架材料中成骨分化蛋白RUNX2的表达。然而PD98059显著抑制了 P-ERK和P-JNK的表达,对P-Smad、P-p38和P-Akt则无明显抑制作用。Micro-CT和茜素红染色结果均显示DMH1在CG-GAG和MC-GAG两种支架材料中均显著抑制了 hMSCs的成骨分化活性和矿物质的沉积。而PD98059抑制剂,只抑制了 CG-GAG支架材料中hMSCs的成骨分化,而对MC-GAG支架材料中hMSCs的成骨分化活性则没有明显抑制作用。进一步对比相关成骨基因ALP、RUNX2 和 BSPⅡ mRNA 的表达,ALP 和 BSPⅡ mRNA 在 DMH1 和 PD98059 的作用下,均有所降低。只有RUNX2 mRNA的表达在DMH1和PD98059中存在显著性的差异。DMH1抑制了 CG-GAG和MC-GAG支架中hMSCs RUNX2 mRNA的表达。而PD98059对CG-GAG和MC-GAG支架中hMSCs RUNX2 mRNA的表达则没有明显抑制作用。综上,典型BMP受体信号通路Smads对CG-GAG和MC-GAG支架材料中hMSCs的成骨分化起主要调控作用。而非典型BMP受体信号通路ERK和JNK在CG-GAG支架材料中也调控hMSCs细胞的成骨分化。但MC-GAG中hMSCs细胞的成骨分化则不受非典型BMP受体信号通路的调控。并且,RUNX2在CG-GAG和MC-GAG支架材料中独立于非典型BMP受体信号通路的调控。结论:氧化石墨烯钠钛板有良好的生物相容性,促进了人牙周膜干细胞的细胞增殖和成骨分化,将在口腔种植领域有更好的临床应用。矿化的胶原糖胺聚糖支架材料能更好的促进人间充质干细胞成骨分化和矿物盐沉积,并独立于非典型BMP受体信号通路的调节,在骨组织工程中有更广阔的应用前景。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R783.1
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本文编号：1326858