人体5-吡咯啉羧酸还原酶突变体结构与功能研究

发布时间：2017-12-24 01:30

  本文关键词：人体5-吡咯啉羧酸还原酶突变体结构与功能研究　出处：《昆明医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：摘要 5-吡咯啉羧酸还原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase,P5CR1)是由 PYCR1基因编码,以NAD(P)H为辅助因子催化5-吡咯啉羧酸还原为脯氨酸的管家蛋白。脯氨酸和5-吡咯啉羧酸循环与氨基酸代谢、线粒体细胞内氧化平衡及凋亡功能有关系。错义P5CR1 SNPs(nonsynonymous SNPs,nsSNPs)引起蛋白结构和功能变化。有报道P5CR1 R119G突变引起结缔组织疾病,导致严重皮肤松弛症(cutis laxa),这一突变影响了线粒体和结缔组织功能,促进大量凋亡发生,这使线粒体功能受损害。本研究通过同源模建及表达纯化构建R119G突变体结构,比较野生型和P5CR1 R119G突变体结构和功能差异。心脏和瓣膜组织是由结缔组织成分组成,我们选取心血管疾病(扩心病、冠心病、高心病、房间隔缺损、室间隔缺损和动脉导管未闭)在P5CR1基因和转录水平进行研究,探索P5CR1突变是否和心血管疾病有关系,及P5CR1在风湿性心脏病二尖瓣狭窄的病理机制。本研究包括如下三部分:1.源于人类P5CR1SNP突变体结构和功能研究;2.点突变对P5CR1功能的影响;3.P5CR1在云南省不同民族转录本形式及其突变在心血管疾病筛查。第一部分源于人类P5CR1 SNP突变体结构和功能研究[目的]P5CR1 R119G SNP与皮肤松弛发病机制有关,然而它的结构(分子基础)和功能仍不清楚。为了阐明R119G突变对P5CR1结构与功能影响。参照野生型的P5CR1结构研究这个位点突变对单体、复合物结构和功能影响,通过计算机模拟方法比较突变体和野生型结构和功能差异。[方法]我们采取了计算机方法检测了 nsSNPs对P5CR1结构和功能影响。在348个确认的SNPs中,根据SIFT和PolyPhen工具预测有害性有nsSNPs,用I-突变和分子对接进行R119G突变蛋白的稳定性及与辅助因子结合亲和力变化,分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟和本质动力学评估R119G突变对P5CR1蛋白单体和P5CR1-NAD+复合物结构动力学改变,结合自由能计算比较野生型和R119G突变体P5CR1复合物与NAD+结合亲和力变化。[结果]在348个确认的SNPs中15个具有危害性。用I-突变和分子对接进行了计算机分析,结果显示R119G突变导致蛋白的稳定性下降及减少了与辅助因子结合的亲和力。分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟结果显示R119G突变增加了 P5CR1结构的刚性,尤其是在辅助因子的结合位点,这将可能减少辅助因子进出的动力学。R119G突变体刚性的增加很可能的原因是内部原子相互作用增加及动态氢键数目的减少。野生型和R119G突变体P5CR1-NAD+复合物结构的分子动力学模拟和本质动力学(essential dynamics,ED)结果提示R119G突变减少了 P5CR1柔性,尤其是底物与NAD+结合口袋,这表明这个位点突变减少了辅助因子进出动力学。MM-PBSA计算结果表明,与野生型比较,R119G突变体与辅助因子NAD+结合亲和力是减弱的,这也表明这个位点突变可能影响了 P5CR1活性功能。[结论]通过计算机预测发现P5CR1 R119G突变体影响了 P5CR1结构和功能,尤其是影响了 P5CR1与NAD+结合口袋。第二部分点突变对P5CR1功能的影响[目的]R119G这个位点突变对P5CR1蛋白酶的结构与活性影响仍没有通过实验进行阐明。因此我们构建R119G突变体载体,比较野生型和R119G突变体P5CR1蛋白酶的活性参数。[方法]通过克隆、表达R119G突变体P5CR1蛋白,通过镍柱和分子筛进行蛋白纯化,通过紫外分光光度计进行酶活性参数(Km、Vmax、Kcat、Kcat/Km)测定。[结果]相对于野生型,R119突变为G减少了对底物3,4脱氢左旋脯氨酸的催化效率及对辅助因子结合亲和力。突变体和野生型酶的活性研究结果显示酶的孵育温度在5℃-37℃时突变体的活性是下降的,提示这个位点突变对温度稳定性是下降的。在37℃几乎没有剩余活性。表明在体内突变体损害了 P5CR1的功能。相反,野生型在37℃是仍有活性,在75℃时几乎失去活性。通过这些实验结果表明R119突变成G可能损害了 P5CR1的功能。[结论]我们的研究结果强调了“chargedpocket”对P5CR1蛋白结构与功能影响。第三部分P5CR1在云南省不同民族转录本形式及其突变在心血管疾病筛查[目的]皮肤松弛是一个结缔组织疾病,心脏和瓣膜组织是由结缔组织成分组成。皮肤松弛相关突变基因通过SIFT和PolyPhen预测软件发现A257T、R251H、G206W、A179T、R119H、R119G危害性是高的,根据这些位点突变我们进行设计了 2对PCR引物,测序验证这些位点突变是否和心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)有关系。探索P5CR1转录本在云南省不同民族分布情况及其是否与心血管疾病有关系。验证P5CR1转录缺失体对P5CR1蛋白结构和功能的影响。对风湿性心脏病(rheumatic heart disease,RHD)和非风湿性心脏病(non-rheumatic heart disease,nRHD)瓣膜P5CR1蛋白进行研究,初步探讨P5CR1在风湿性心脏病二尖瓣狭窄的发病机制。[方法]我们选取心血管疾病197例;扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)40例和冠心病64例,先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)93例,包括房间隔缺损(atrial septum defect,ASD)66 例、室间隔缺损(ventricular septal defect,VSD)11 例和动脉导管未闭(patent ductus arteriosus,PDA)16 例。从这些患者中抽取外周血提取DNA,进行PCR扩增、测序。选取少数民族人群,先天性心脏病11例,和汉族人群58例,先天性心脏病15例,高血压心脏病10例,冠心病30例,健康对照3个病例,外周血提取RNA,逆转cDNA,以cDNA为模板进行PCR后测序。对风湿性心脏病和非风湿性心脏病瓣膜组织P5CR1蛋白进行免疫印迹和免疫组化。[结果]测序结果发现一例房间隔缺损的患者存在C-T突变,在内含子区。我们发现的转录本形式,是在第五个外显子缺失(命名缺失体),与野生型比较少了 93个碱基,编码31个氨基酸。58例汉族人群都是以这个缺失体形式存在,纳西族1例和佤族2例是全长cDNA。苗族1例、回族1例和白族1例存在缺失体,然而傣族2例(1例存在缺失体,1例存在全长cDNA),彝族3例(1例存在缺失体,2例存在全长cDNA),说明有的少数民族只存在缺失体形式,有些少数民族既存在缺失体也存在全长cDNA。这些结果提示DNA转录本在云南不同民族具有差异性。实验结果提示缺失体蛋白的催化效率类似于野生型的蛋白,然而缺失体蛋白对温度耐受性是下降的。发现瓣膜组织存在P5CR1基因和蛋白表达,免疫组化结果提示风湿性心脏病二尖瓣纤维化程度有加重趋势。[结论]P5CR1蛋白可能与风湿性心脏病二尖瓣纤维化程度有关系。P5CR1转录缺失体形式在不同民族具有差异性。缺失体蛋白酶催化效率类似于野生型蛋白。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

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本文编号：1326350