酪氨酸去磷酸化增强表皮生长因子受体在乳腺癌治疗中靶向性的研究

发布时间：2017-12-24 00:16

本文关键词：酪氨酸去磷酸化增强表皮生长因子受体在乳腺癌治疗中靶向性的研究　出处：《山东大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一类名为表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)家族的细胞外蛋白配体的细胞表面受体。表皮生长因子受体是ErbB受体家族的成员之一,ErbB家族是包含四种紧密联系蛋白的亚家族,这四种蛋白分别是受体酪氨酸激酶类：EGFR (ErbB-1)、 Her2/c-neu (ErbB-2)、Her 3 (ErbB-3)以及Her 4 (ErbB-4)。影响EGFR表达水平异常或活性的突变很有可能导致多种癌症。EGFR是一种跨膜蛋白,它的结构包括细胞膜外的配体结合区域、跨膜区域以及胞内区域。其可激活的磷酸化位点位于胞内部分,包括Y992、Y1068以及Y1173等。雌激素受体(estrogen receptor, ER)是主要由雌激素(17β雌二醇)激活的一种类雌激素受体。一旦被雌激素激活,ER能够被活化随之易位到细胞核中并与DNA结合以调节不同基因的活性一一它是一种主要功能位于核内的DNA结合转录因子。雌激素受体ER在半数以上的乳腺癌中表达,其蛋白水平的高表达是乳腺癌的致癌因素之一,同时ER也是比较传统而且重要的乳腺癌内分泌治疗指标,医学科学界针对ER的研究一直是乳腺癌治疗研究的热点之一,而且临床治疗方面已经拥有了针对ER的比较成熟的治疗药物如他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)。在之前的研究中,本实验室已经发表一篇文章阐述了PTPH1对ER的调节作用。蛋白酪氨酸磷酸酶H1 (protein tyrosine phosphatase H1, PTPH1),从基因层面也被叫做酪氨酸蛋白磷酸酶非受体类型3 (tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 3, PTPN3),是由PTPN3基因编码并且表达的酶。PTPH1是蛋白质酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs)家族的一个成员,主要在细胞质中发挥功能。多种研究显示PTPs家族成员大多可调节多种细胞自身活动,包括细胞生长、分化、有丝分裂周期以及致癌性转化等。研究证实PTPH1在乳腺癌中有50%的表达率,对乳腺癌的临床诊疗工作有着重要的科研价值。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI),是一类可以针对性地抑制酪氨酸激酶发挥正常作用的化合物。其主要生理作用是阻断ATP中的磷酸根结合酪氨酸残基,从而达到控制癌细胞增殖的作用。现今比较有效的TKI类药物如：拉帕替尼(Lapatinib, LAP)以及吉非替尼(Gefitinib, GEF),前者的主要治疗靶点是EGFR蛋白以及Her2蛋白,国际上主要用于乳腺癌晚期、乳腺转移癌以及联合治疗；后者的主要治疗靶位是EGFR。本课题组在早先研究中观察到：PTPH1会对雌激素受体ER的Y537位点去磷酸化,同时增加ER的核内转移活动,从而提升乳腺癌细胞对雌激素受体拮抗剂他莫昔芬的敏感性；此外,本实验室己发表文章中阐述了PTPH1可以对表皮生长因子受体EGFR的Y1173位点进行去磷酸化的可能。综合上述发现,我们考虑PTPH1蛋白水平变化意义重大：PTPH1对EGFR在Y1173位点的去磷酸化很可能具有潜在的调节TKI类抗肿瘤药物一一如拉帕替尼和吉非替尼敏感性的可能；而针对PTPH1可以同时调节EGFR与ER两种蛋白分子,我们设计实验探讨PTPH1对TKI类药物与ER拮抗剂联合用药效果的影响,并针对上述一系列设想建立了课题思路。研究方法为了检验上述假设,我们预先设计了三部分比较系统性的实验。在第一部分实验中,选用PTP H1过表达癌细胞、正常表达PTPH1的同细胞系癌细胞以及PTPH1敲低癌细胞株进行相关TKI抗癌药物(拉帕替尼Lapatinib,吉非替尼Gefitinib)敏感性实验,以检测PTPH1表达水平对所选择药物抗癌效果的影响。在第二部分实验中,对相关细胞系进行有条件的培养,随后用Western blot实验检测PTPH1是否可以调节相关抗癌药物的靶向蛋白EGFR蛋白水平、稳定性以及相关位点的磷酸化水平。最后第三部分研究计划,包涵了一系列综合实验,包括Western blot、免疫沉淀、核浆分离实验等对PTPH1调节EGFR的膜易位、ER的核内易位以及ER与EGFR的相互作用进行了研究分析,同时这部分实验可以综合性地探讨PTPH1是否能够分别调节EGFR蛋白水平和促进ER转移到细胞核内,从而增强相关靶向治疗药物(TKI类药物和他莫昔芬Tamoxifen)对乳腺癌细胞的联合抑制作用。上述实验构成了一整个体系,探讨PTPH1对TKI类药物(以及与他莫昔芬联合用药)的敏感性调节及其原理。结果1.PTPH1提升了乳腺癌细胞对TKI类药物的敏感性：PTPH1表达水平的提高特异性增强了MCF7、T47D以及MDA-MB-231 (231)细胞对TKI类药物(拉帕替尼和吉非替尼)的敏感性；而在同类细胞系当中,如果PTPH1蛋白被敲低会下调TKI类药物的效果——PTPH1水平降低之后细胞耐药性出现。PTPH1水平决定了癌细胞对TKI类药物的抵抗。2. PTPH1可以对EGF R在Y1173位点上进行去磷酸化。与PTPH1正常表达的对照组相比,PTPH1过表达细胞中Y1173位点的磷酸化水平明显降低,而且这种去磷酸化作用也存在于体外293T细胞中；反之PTPH1敲低的细胞系的Y1173磷酸化水平获得上调。PTP HI对Y1173位点的去磷酸化依赖其自身催化能力,失去催化能力的PTPH1突变体PTPH1/S459A和PTPH1/DA没有去磷酸化功能。3. PTPH1可以上调EGFR蛋白表达水平：Western Blot证实在PTPH1过表达细胞中,EGFR的水平明显高于PTPH1正常表达细胞；反之,癌细胞中的PTPH1敲低之后,EGFR水平随之下降。PTPH1失去磷酸化功能的突变体PTPH1/S459A无法上调EGFR蛋白。在体外293T细胞中,PTPH1上调EGFR蛋白的功能仍然存在。放线菌酮(Cycloheximide, CHX)实验证实PTPH1上调EGFR蛋白的原因主要为增强EGF R蛋白的稳定性；EGFR的突变体EGFR/Y1173F存在不依赖PTPH1的高稳定性；PTPH1的突变体PTPH1/S459A无法提高EGFR蛋白的稳定性。泛素实验证实PTPH1过表达导致泛素介导的EGFR蛋白降解减少；EGFR/Y1173F存在PTPH1非依赖性泛素化降解减少。相关细胞集落实验发现EGFR过表达明显提高TKI的药物作用；PTP H1过表达提升TKI药物对肿瘤细胞的抑制作用;EGFR/Y1173F过表达导致了乳腺癌细胞对TKI药物的耐药性,而且这种耐药性无法被PTPH1调节。最重要的是,免疫组化实验证实在临床标本中,PTPH1与EGFR蛋白水平呈明显的正相关。4. PTP H1可以降低EGF R与ER的相互作用。核浆分离实验证实,PTPH1不仅可以促进核内ER水平提高,而且促进了EGFR在细胞膜上的富集。免疫沉淀实验发现：PTPH1过表达可以降低EGFR与ER的结合,使EGFR-ER复合物水平降低；PTPH1/S459 A无法降低EGFR与ER的相互作用。结合相关细胞集落实验我们推测,EGFR与ER的相互作用可影响TKI药物的作用。5.ER的核内蛋白水平升高导致EGFR与ER的相互作用减弱。免疫沉淀实验发现：细胞质中的ER可以与EGFR相结合,产生EGFR-ER复合物；ER的突变体ER/T311A核内蛋白降低,与EGFR产生的复合物增加。相关细胞集落实验显示：ER/T311A过表达组与野生型ER过表达组相比,耐药性增强。我们推测EGFR-ER复合物导致了细胞对TKI产生耐药性。6. PTPH1提高乳腺癌细胞对TKI与他莫昔芬(TAM)联合用药的敏感性。细胞集落实验显示：PTPH1过表达可以分别提高TKI类药物或者他莫昔芬的作用；PTPH1过表达对于TKI与他莫昔芬联合用药效果的提升作用更为显著；PTPH1的突变体——没有去磷酸化作用的PTPH1/S459A无法提高乳腺癌细胞对TKI与他莫昔芬联合用药的敏感性。结论1. PTPH1增加乳腺癌细胞对TKI类药物的敏感性。2. PTP H1在体外细胞和乳腺癌细胞中均可对EGFR在Y1173位点进行去磷酸化。3. PTPH1通过对EGFR的Y1173位点的去磷酸化增加EGFR的稳定性。4.PTPH1通过催化活性降低EGFR-ER复合体的水平,从而提高TKI类药物与ER拮抗剂联合用药对乳腺癌细胞的抑制作用。意义本课题的实验结果表明,EGFR蛋白水平对于TKI类药物乳腺癌治疗的敏感性起到了关键性指示作用；经PTPHI调节,EGFR的关键残基Y1173在进行去磷酸化之后增加了EGFR稳定性,同时影响了TKI类药物的效果。首先,我们证实PTPH1可在Y1173位点对EGFR进行去磷酸化；其次,我们还发现PTPH1可以增强EGFR蛋白的稳定性和细胞膜EGFR蛋白水平。这些结果表明,PTPH1可能参与了EGFR磷酸化水平调节环路；最重要的是,PTPH1利用其磷酸催化活性增加了EGFR细胞膜定位,而且对Y1173位点去磷酸化以提升表皮生长因子受体EGFR蛋白的稳定性。此外,PTPH1不仅有己发现的对ER进行去磷酸化并增加其核移位的作用,还可以对EGFR的Y1173位点去磷酸化,促使EGFR向细胞膜富集,上述功能降低了EGFR-ER复合体生成,促进了EGFR靶向治疗药物的抗癌作用。综上,由PTPH1诱导的EGFR/Y1173去磷酸化上调乳腺癌EGFR膜受体可能是一种提高其靶向治疗药物临床效果的方法；结合PTPH1的ER核异位调节功能,PTPH1调节EGFR和ER相互作用的功能在乳腺癌联合用药治疗中有着重要的可研究价值,对于将来设计研究进一步克服药物治疗耐药性的课题提供了方向。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

【相似文献】