介孔硅—烷基化壳聚糖复合快速止血材料的制备及性能研究

发布时间：2017-12-24 20:03

本文关键词：介孔硅—烷基化壳聚糖复合快速止血材料的制备及性能研究　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：课题研究背景:过度失血是战伤致死的主要原因,也是事故和手术治疗过程中伤病员致死的主要因素。研究显示战现场50%伤员致死率由不可控失血导致,即使伤员能被送至医院抢救,大量失血仍会造成后期较高的死亡率和严重的并发症,由于应急救护黄金时间只有10分钟,因此,战现场快速止血显得尤为重要。目前,快速止血产品主要有高分子有机类和无机类,但都存在一定的缺陷,有机类止血效果不稳定,无机类易残留脉管内引起血栓。因此,急需一种即止血迅速同时对身体无损伤的战现场止血材料。介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)是无机类物质优化后的产物,其大比表面积、介孔结构、表面负电荷对凝血有很好的促进,然而什么结构的介孔硅凝血效果最好至今仍无定论。壳聚糖一直是止血材料的好选择,但过往壳聚糖止血已达一个瓶颈,近年烷基化壳聚糖表现出更好的凝血效果。由于壳聚糖带正电而介孔硅带负电,因此以烷基化壳聚糖负载介孔硅,即可防止介孔硅残留体内,又同时提高凝血能力,有望制备出一种高效安全的快速止血剂。课题研究目的:通过调整介孔硅粒径、介孔尺度以及壳聚糖脱乙酰度、烷基链长度,通过体外、体内凝血指标评价和生物相容性检测得到止血效果最优的介孔硅和烷基化壳聚糖,二者复合后经凝血效果和生物安全性评价探索最好的复合模式,从而制备一种在血液系统性、整体性发挥作用的同时能最小化不良反应的快速止血材料。课题研究方法:(1)根据协同自组装原理,采用硬模板法制备介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN),通过改变模板剂的量和制备参数,制备出不同孔径、粒径的介孔硅。通过透射电镜、DLS、BET、XRD、FTIR检测介孔硅物理特性,通过CBT、FXII吸附、PT、APTT、TEG检测不同介孔硅对血凝影响,通过细胞内吞、死/活细胞、CCK-8检测介孔硅生物相容性。最终,筛选出凝血效果最好的介孔硅并通过兔股动脉止血实验检测介孔硅体内凝血能力;(2)选取270k分子量的壳聚糖,通过非均相反应制备脱乙酰度100%壳聚糖(CS)。使用还原胺法制备烷基化壳聚糖(AC)。通过FTIR、紫外、元素分析、1H NMR判断烷基接枝情况,通过CBT、APTT、PT、TT检测血凝,通过血小板、红细胞黏附检测烷基化壳聚糖凝血机理。最终探索烷基化壳聚糖相较于CS促凝的机理并得到凝血效果最佳的烷基化壳聚糖;(3)复合性能最佳的介孔硅和烷基化壳聚糖,改变制备方法,得到各形态的复合止血材料,即海绵、微球、纱布黏附。CBT检测确定复合模式后,改变壳聚糖与介孔硅比例,制备系列复合材料。通过SEM、TEM、红外、TGA、DSC检测复合情况和CBT判定最佳符合比例后,APTT、PT、TEG检测复合材料与高岭土凝血效果差异,死/活细胞、CCK-8体外检测复合材料与Combat Gauze细胞毒性差异,体外血小板黏附、全血黏附吸收检测材料与比较Combat Gauze体外凝血性能,最后通过大鼠肝出血实验和兔股动脉止血实验检测比较止血材料与Combat Gauze体内止血能力。实验结果:(1)通过有机模板法成功制备系列不同孔径、不同粒径的MSN,体外凝血性能检测显示孔径越大凝血效果越好,而介孔硅粒径的变化对凝血性能几乎无影响;生物相容性结果显示介孔硅能促进细胞分化且孔径越大促进效果越明显,而粒径增大对细胞活性起负作用,结合体外凝血性能检测结果说明MSN15+60是最适宜作为止血剂的MSN;兔股动脉出血的快速止血效果进一步验证MSN15+60的止血性能,因此,MSN15+60是凝血效果最佳的介孔硅;(2)非均相间歇处理法制备脱乙酰度100%的壳聚糖,还原胺法成功制备一系列接枝不同烷基和不同取代度的烷基化壳聚糖;细胞毒性分析显示AC生物相容性很好,其安全性达到止血剂的要求,能作为基质与MSN复合制备止血材料;从凝血蛋白、血小板、红细胞三方面出发体外分析AC凝血机理,结果显示AC相较于CS促凝的原因是AC能促进红细胞的细胞行为,而不是血小板或者凝血因子;体外凝血显示低取代度、长烷基链的AC凝血效果更好,因此,5%取代度、十八烷基接枝的AC是凝血效果最突出的烷基化壳聚糖;(3)改善MSN15+60和十八烷基壳聚糖的制备方法,制备不同形式的介孔硅-烷基化壳聚糖复合材料,CBT确定最佳复合形式为海绵。改变MSN和AC的投料比以及调整甘油的加入量,理化分析及体外凝血性能检测确定MSN、甘油和AC的最佳质量比为10:23:40。体外凝血性能分析结果显示,MSN-GACS各项凝血指标均比其原料MSN和AC要突出,且相比于高岭土或CG,MSN-GACS用于止血也有很大的优势;体外细胞毒性结果显示MSN-GACS对细胞无任何毒性,而CG对细胞生长有一定的抑制作用,说明MSN-GACS比CG更适宜作为止血剂;体内止血实验和毒性评价比较MSN-GACS和CG的体内止血性能和止血预后效果,结果表明MSN-GACS比CG更适宜作为急性大出血和较轻量出血的止血剂,其良好的生物相容性保证止血后生物体良好的预后效果。因此,本研究制备的MSNGACS是一种理想的战现场快速止血材料,经过后期的扩试有望成为新一代高效止血剂。实验结论:(1)介孔硅凝血性能与孔径有关而与粒径无关,且孔径越大,凝血性能越好,现今制备工艺中粒径60 nm、孔径15 nm的介孔硅止血效果最好;(2)5%取代度下的十八烷基壳聚糖凝血性能较好,烷基化壳聚糖凝血差异主要来源于其对红细胞的作用;(3)介孔硅与烷基化壳聚糖复合海绵的形式下凝血效果好,以壳聚糖:甘油:介孔硅=40:23:10比例合成的MSN-GACS止血效果和生物安全性均优于CG,MSN-GACS有望取代CG成为新型战现场快速止血材料。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R318.08

【参考文献】