热休克蛋白90α对静脉淤血型皮瓣缺血再灌注损伤的实验研究

发布时间：2017-12-25 13:07

本文关键词：热休克蛋白90α对静脉淤血型皮瓣缺血再灌注损伤的实验研究　出处：《青岛大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:通过建立大鼠静脉淤血型皮瓣缺血再灌注损伤模型,对皮瓣局部注射外源性热休克蛋白90α的功能基因“F-5”表达蛋白,观察皮瓣血流灌注量变化、微血管新生情况及对皮瓣成活率的影响,进而探讨热休克蛋白90α对皮瓣缺血再灌注损伤的作用机制,并为后续研究提供理论基础,也为该方面的临床治疗技术的转化提供实验依据。方法:在这项研究中,首先获取外源性热休克蛋白90α的功能基因“F-5”表达蛋白。通过基因工程技术构建p ET15b-F-5重组质粒,转化大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL菌株;在细菌培养扩增后,挑选抗氨苄青霉素克隆进行快速提取,用Eco R I、Bam H1双酶切鉴定;将大肠杆菌菌种通过碱裂解法大量提取目标质粒;以氮川三乙酸镍(Ni-NTA)金属亲和层析纯化;通过Centricon YM-50装置浓缩,然后用快速蛋白液相色谱法(FPLC)再次纯化;用考马斯亮蓝法(Bradford法)对纯化蛋白进行定量,获得最终浓度为1mg/ml的外源性热休克蛋白90α“F-5”表达蛋白。其次建立轴型皮瓣的静脉淤血型缺血再灌注损伤模型。设计以大鼠腹壁浅动静脉为蒂的轴型皮瓣,成功切取皮瓣后,除轴型供血血管——腹壁浅动静脉与供区连接外,其余组织均游离;用微型止血夹夹住腹壁浅静脉6小时或8小时造成静脉回流障碍,之后再通血管,出现再灌注损伤。将60只大鼠随机分为三个组:A组为空白对照组,在静脉淤血型皮瓣缺血再灌注损伤模型建立后,在血管再通即刻皮下组织层注射1ml生理盐水;B组为热休克蛋白90α预处理组,在静脉阻断前于皮瓣局部注射热休克蛋白90α1ml(总量1mg);C组为热休克蛋白90α治疗组,在静脉淤血型皮瓣缺血再灌注损伤模型建立后,血管再通即刻皮下组织层注射相同数量热休克蛋白90α“F-5”基因表达蛋白。每组又分为两个再灌注时间点,即缺血6小时或8小时。然后在模型建立过程中采取多种方式对各组皮瓣进行观察,量化对比数据。用激光多普勒血流仪检测各组皮瓣阻断后1小时、3小时、6小时、8小时及再灌注后5分钟、30分钟、2小时血流灌注量,以便辅助判断大鼠皮瓣缺血再灌注损伤的模型是否成功以及再灌注后各组皮瓣血流灌注量的恢复情况。术后每天观察皮瓣的颜色、质地、厚度、毛发生长、毛细血管充盈试验,针刺出血情况等;在术后第7日通过坐标贴纸法测定三组皮瓣的成活率;在术后第1、3、7、10、14日取样进行苏木素—伊红染色及免疫组化染色,观察皮瓣组织的病理性改变以及微血管密度计数。结果:通过Western blotting检测,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中出现87KD条带,说明提纯物为目的蛋白即热休克蛋白90α“F-5”基因表达蛋白;通过RT-PCR及Southern blotting检测,琼脂糖凝胶电泳中在550bp和332bp处出现条带,与质粒载体及热休克蛋白90α“F-5”基因的m RNA分子量吻合,证明提纯物为目的蛋白即“F-5”基因蛋白。血流灌注量改变:正常情况下大鼠下腹部皮瓣的血流灌注量为(397.4±26.7),在阻断静脉1小时后各组皮瓣的血流灌注量均明显降低,其中空白对照组和热休克蛋白90α治疗组皮瓣血流灌注量降为正常的40%左右,阻断6小时血流灌注量降为21%,阻断8小时血流灌注量降为15%以下;而血流恢复后再灌注5分钟到半小时,皮瓣血流灌注量逐渐有所恢复,空白对照组、热休克蛋白90α治疗组、热休克蛋白90α预处理组恢复幅度依次增加,但同一组内对比6小时亚组及8小时亚组,后者皮瓣的血流灌注量恢复幅度对应有明显下降;热休克蛋白90α预处理组在静脉阻断过程中及再灌注后皮瓣的血流灌注量较空白对照组及热休克蛋白90α治疗组为高。激光多普勒血流仪测量影像也可见到不同组别血流灌注量的色差变化,上述变化说明轴型皮瓣的缺血再灌注损伤模型的构建是成功的。热休克蛋白90α预处理组在缺血和再灌注各时间节点的皮瓣血流灌注量显著高于空白对照组,也优于热休克蛋白90α治疗组,组间对比有显著性差异(P0.05)。大体观察:术后第1日空白对照组皮瓣肿胀明显,皮瓣的中远端不同程度出现紫红或紫黑色,毛细血管充盈时间延长或消失,伴皮纹消失,有的出现水泡;热休克蛋白90α预处理组和热休克蛋白90α治疗组水肿较空白对照组轻,有毛细血管充盈现象,时间基本正常。术后3日空白对照组皮瓣仍有肿胀,远端坏死区域发黑,周围伴炎性反应;热休克蛋白90α预处理组和热休克蛋白90α治疗组皮瓣肿胀开始消退,较空白对照组术后第4日消退为早,远端发黑区域范围小,炎症反应轻。术后7日三组皮瓣坏死界限清楚,空白对照组皮瓣远端坏死部分发硬,有融痂现象,坏死组织部分脱落形成溃疡;热休克蛋白90α预处理组和热休克蛋白90α治疗组皮瓣成活范围及营养情况均较空白对照组好。术后第14日,空白对照组坏死组织黑色痂壳脱落,下面组织愈合不佳,有肉芽组织生成;热休克蛋白90α预处理组和热休克蛋白90α治疗组皮瓣创缘愈合好,皮瓣柔软、温暖,皮瓣表面有新生毛发生成。同组内阻断6小时组各项指标情况优于阻断8小时组,其中空白对照组阻断8小时组有2例皮瓣出现完全坏死。皮瓣成活率:术后7日测量各组皮瓣成活率,空白对照组的平均值为(19.3±3.8)%,热休克蛋白90α预处理组为(85.6±17.6)%,热休克蛋白90α治疗组为(78.9±20.5)%,热休克蛋白90α预处理组皮瓣成活率最高,结果有显著性差异(P0.05);同组内缺血6小时亚组皮瓣成活率均高于缺血8小时亚组,差异具有统计学意义(P0.05)。病理组织学改变:术后1、3、7、10、14日对各组皮瓣组织行HE染色进行观察。术后第1日,各组皮瓣组织中均可见到浸润的炎症细胞,毛细血管扩张明显,血小板黏附于血管壁,伴细胞肿胀,尤其以空白对照组为著,还可观察到微血管结构模糊。术后3日,各组皮瓣细胞肿胀未消退,血管壁仍有大量炎性细胞浸润;空白对照组可见血管内血栓形成,细胞肿胀程度较热休克蛋白90α预处理组和热休克蛋白90α治疗组明显。术后7日,热休克蛋白90α预处理组和热休克蛋白90α治疗组显示皮瓣的组织结构基本正常,皮肤的角质层较完整,组织结构基本正常,皮肤的角质层较完整,血管基本保持通畅,纤维组织排布整齐,炎性细胞的浸润减少,成纤维细胞的数量增加,毛细血管密度增加,有新的上皮组织生成;空白对照组皮瓣的组织结构不完整,部分区域出现角质层脱落,血管内有血栓形成,血管壁附近仍有较多浸润的炎性细胞,血管内皮细胞和成纤维细胞增殖较少,鲜见新生毛细血管生成。术后10日,热休克蛋白90α预处理组和热休克蛋白90α治疗组皮瓣组织结构恢复正常,在边缘坏死区域下炎性细胞浸润减少,新生毛细血管增多并伴新生组织生成;空白对照组血管壁炎性细胞数量有所减少,新生血管及新生组织不显著。术后14日,热休克蛋白90α预处理组和热休克蛋白90α治疗组显示炎性细胞数量进一步减少,新的毛细血管和成熟的成纤维细胞增加,细胞排列整齐,新的上皮组织增加,同时可见基底细胞增生;空白对照组炎性细胞数量较前进一步减少,但局部组织新生血管少,上皮细胞增生不活跃。微血管密度计数情况:术后1、3、7、10、14日对各组皮瓣组织行免疫组化染色并对微血管密度进行计数。发现术后7日各组皮瓣组织中棕色的血管内皮细胞较前增多,其中热休克蛋白90α预处理组和热休克蛋白90α治疗组较空白对照组增多明显。通过微血管密度计数对比,各组间差异具有统计学意义(P0.05)。另外,缺血6小时亚组的参数均优于缺血8小时亚组,差异显著(P0.05)。术后10日,热休克蛋白90α预处理组和热休克蛋白90α治疗组伤口附近可见新生上皮组织,甚至可见清晰的新生血管。术后14日,热休克蛋白90α预处理组和热休克蛋白90α治疗组皮瓣远端皮缘愈合良好,局部黑痂脱落,可以看到较完整的表皮和真皮结构,伴新生血管的增加。结论:通过质粒重组、扩增、提纯等方式可以获得有活性的外源性热休克蛋白90α“F-5”基因表达蛋白;轴型皮瓣静脉淤血型缺血再灌注损伤的大鼠模型的建立是可靠的,阻断静脉的时间控制在6小时左右为宜;外源性热休克蛋白90α“F-5”表达蛋白可增加皮瓣血流再灌注量、降低细胞渗透,促进新毛细血管的形成,从而提高皮瓣存活率,对静脉淤血型皮瓣缺血再灌注损伤有较好的治疗作用,而在缺血发生前使用的效果优于缺血再灌注损伤发生后使用。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R622

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