酪氨酸激酶抑制剂对肿瘤相关巨噬细胞M2样极化的影响

发布时间：2017-12-29 12:03

本文关键词：酪氨酸激酶抑制剂对肿瘤相关巨噬细胞M2样极化的影响　出处：《浙江大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：科学研究表明,肿瘤相关巨噬细胞M2型极化在各种类型肿瘤的血管生成、肿瘤生长以及转移等过程中扮演了重要的角色。在肿瘤组织中,巨噬细胞的不同作用支持着肿瘤的生长或是癌细胞的转移。一些临床研究显示,肿瘤相关巨噬细胞(简称TAMs)的高度浸润与乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌以及宫颈癌的临床不良预后之间有相关性。之前的假说提出了 TAMs参与到机体的抗肿瘤作用当中,但最近许多临床和科学研究已经证明在大多数情况下TAMs会促进肿瘤的恶性进程。越来越多的研究表明,TAMs具有不同的作用,既可以增加细胞毒性化疗药物、癌细胞靶向抗体及免疫治疗药物的抗肿瘤功效,也有可能发挥对抗药物的作用。由于TAMs在癌症的生长与转移中发挥着多重的作用,因此,发展靶向于这些细胞的新策略是非常重要的。而且,靶向TAMs将是一项有前途的治疗策略。通常靶向TAMs主要有两个策略,一方面是减少TAMs在肿瘤组织中的密度;另一方面则是将TAMs的类型从促肿瘤型转化杀灭肿瘤类型。然而,靶向TAMs策略距离在临床的应用仍然有一定的距离,很多问题仍然未解决。因此,有许多实验仍在开展,目前大部分数据显示该策略可以使肿瘤体积大幅度减小具有较好的治疗效果,这些都将为临床应用做铺垫。可塑性和异质性是巨噬细胞的主要特点,因此在肿瘤微环境中不同的刺激下,TAMs会极化成为不同类型,发挥预防肿瘤或是促进肿瘤的生长的不同作用。在肿瘤中,巨噬细胞主要极化为两种不同的表型,分别是经典活化的M1型和替代活化的M2型。在非恶性肿瘤中,肿瘤相关巨噬细胞主要大多数经由干扰素Y(IFN-γ)或脂多糖(LPS)诱导极化成为M1型巨噬细胞,具有释放促炎症细胞因子、Th1抗原呈递以及促进肿瘤溶解的功能。相反地,M2型极化的巨噬细胞具有促肿瘤和抗炎的活性。IL-4,IL-13,IL-10和糖皮质激素均可诱导巨噬细胞发生M2型极化。M2型巨噬细胞可进一步分为三种不同的亚型M2a,M2b和M2c型巨噬细胞。这些极化的不同亚型取决于特定类型配体与受体的相互作用,在调节炎症、免疫和肿瘤抑制中发挥极其重要的作用。Th2型细胞因子如IL-4、IL-13可诱导M2a型极化;M2b型主要由免疫复合物TLRs激活;糖皮质激素和IL-10可激活M2c型巨噬细胞。M2型巨噬细胞高度表达IL-10,IL-1诱饵受体以及IL-1Rα,少量分泌CCL-22,CCL-17,低表达IL-12。IL-13受体激活STAT6信号通路进而增加M2型极化基因转录如甘露糖受体(Mrc1,几丁质酶3(Chil3,Ym1,抵抗素类似物(Retnla和Fizz1,这些都是M2型极化所必不可少的。TAMs在肿瘤的发展过程中与M2型巨噬细胞功能类似,具有抗炎功能,能够促进血管生成和组织重构以及抑制抗肿瘤免疫反应。STAT6是IL-4/IL-13介导的M2型极化中主要的转录因子,能够显著调节炎症与过敏反应间的平衡。STAT6调控巨噬细胞M2型极化相关基因例如Arg1,Mrc1以及Ym1的表达。因此M2型极化的TAMs是很有前途的辅助抗癌治疗的靶点。然而,TAMs和肿瘤细胞之间的相互作用相当的复杂,而且目前仍未被清楚地阐明。最重要地,TAMs能否增加肿瘤生长仍然存在争议。过去的几十年中,一些新型的靶向TAMs的抗癌疗法,例如化疗、靶向治疗、联合治疗和免疫治疗已经发展了起来并且进行着广泛的实验。此外,重新极化为M1型巨噬细胞,减少TAMs的募集,抑制TAMs的M2型极化以及阻断M2型TAMs的促肿瘤功能,都或将成为抗肿瘤的新策略。靶向治疗是指新一代旨在干扰特定分子靶点的抗癌药物,这些靶点通常是一些在肿瘤的生长与发展中具有重要作用的蛋白。酪氨酸激酶是一类可以调节细胞增殖、生长、迁移、分化和死亡的激酶,因此是一个很有前途的癌症治疗靶点。在本课题研究中,我们考察酪氨酸激酶小分子抑制剂(TKI)如达沙替尼,厄洛替尼,吉非替尼和拉帕替尼是否具有抑制TAMs的M2型极化的活性。最初我们将这四个化合物作用在小鼠巨噬细胞RAW264.7,小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞BMDMs,小鼠路易斯肺癌细胞LLCs和人肝癌细胞HepG2上,在这些细胞上进行细胞存活实验,考察它们细胞增殖的抑制作用。将一系列梯度浓度的药物作用细胞上,筛选出在这四种细胞中均无严重增殖抑制作用的最佳浓度。达沙替尼是一种三磷酸腺苷的竞争性抑制剂,主要作为Src家族和Abl酪氨酸激酶的双重抑制剂。它也是一种非常有效的ephrin受体家族成员KIT和PDGF受体的抑制剂。在本课题的研究中,我们发现达沙替尼在Raw264.7和BMDMs细胞上均能有效抑制由IL-13所诱导的巨噬细胞M2型极化。当Raw264.7细胞经10ng/ml的IL-13给药72h,细胞表面标记物CD206的的表达明显上调。当同时给予0.038μM的达沙替尼后表面标记物CD206的表达有一定程度的下降。相似地,在BMDMs细胞中也能观察到表面标记物CD206的表达有类似的变化,其表达随达沙替尼的浓度的升高而降低。为了进一步证实达沙替尼在M2型极化中的作用,采用了实时定量PCR的方法检测M2型标记基因的mRNA的水平。与IL-13单用组相比,同时给予0.038μM的达沙替尼后,M2型标志基因Mrc1、Ym1、Fizz1和Arg1的mRNA水平显著降低。这些结果证实达沙替尼可抑制IL-13诱导的巨噬细胞M2型极化。厄洛替尼是另一种酪氨酸激酶抑制剂,主要用于治疗已经扩散到身体其他部位,具有特定类型表皮生长因子受体(EGFR)突变的非小细胞肺癌(NSCLC。在本课题中,我们研究了厄洛替尼对IL-13诱导的巨噬细胞M2型极化的作用。在体外实验中,厄洛替尼可抑制巨噬细胞M2型极化,具体表现为下调了 M2表面标志物和M2型标志基因的mRNA水平。由于这个化合物具有良好的抑制巨噬细胞M2型极化的活性,因此我们在不同的肿瘤细胞中开展进一步体外以及体内研究。在肿瘤微环境中IL-13可诱导巨噬细胞发生替代活化的M2型极化。IL-13与其受体的结合主要激活了 STAT6和PI3K两条信号通路。然而,IL-13在巨噬细胞极化方面的作用仍然具有争议的。TAMs的募集,特别是M2型极化的TAMs在肿瘤发生中的作用非常重要,因此是肿瘤治疗中非常有吸引力的靶点。我们的研究首次发现吉非替尼对IL-13诱导的巨噬细胞M2型极化具有抑制作用。吉非替尼,一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂,是一种小分子药物,被批准用于治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌。它对多种肿瘤细胞和大部分小鼠移植瘤模型均具有良好的抗肿瘤活性。在体外实验中,我们证明了吉非替尼能够显著抑制由IL-13诱导的巨噬细胞的M2型极化,主要表现为M2表面标记物CD206和CD163的下调和M2型标记基因Mrc1,Arg1,Ym1和Fizz1的mRNA水平的下调。进一步,我们通过划痕实验测定不同条件培养基对LLCs细胞的运动能力的影响,从而分析吉非替尼对巨噬细胞促血管生成功能的影响。我们发现经IL-13处理的巨噬细胞的条件培养基在24h的时候能够促进LLC细胞的运动能力,而同时给予IL-13和吉非替尼合用的条件培养基组并没有这个现象,单用吉非替尼处理的巨噬细胞的条件培养基也没有这个效果。通过transwell实验考察LLC和RAW264.7细胞在不同条件培养基中的迁移能力的变化,实验结果显示,经IL-13处理的巨噬细胞条件培养基能够促进LLC和RAW264.7细胞的迁移,而同时给予吉非替尼组的条件培养基没有该促进作用。紧接着,我们发现,吉非替尼在抑制IL-13诱导的M2型巨噬细胞极化过程中,抑制STAT6的磷酸化。巨噬细胞极化主要通过PI3K/Akt、Mapk/Erk和p38通路。而吉非替尼也可以降低Akt,Erk1/2,P38的磷酸化。AMPKα是小鼠巨噬细胞表达的主要亚基,我们进一步考察在IL-13诱导的巨噬细胞M2型极化过程中,给予或是不给予吉非替尼,AMPKα和其下游信号通路ACC磷酸化水平的变化。在RAW264.7细胞中,给予IL-13并不会影响AMPKα和ACC蛋白的磷酸化水平。然而吉非替尼给予后,则能显著引起AMPKα和ACC的磷酸化水平上调,同时增加IL-13诱导的巨噬细胞M2型极化中AMPKα和ACC的磷酸化。在体内实验中,我们证明了吉非替尼通过抑制肿瘤组织中巨噬细胞M2型极化从而有效地抑制了 LLC肿瘤的转移。吉非替尼能够显著降低肿瘤组织中CD206阳性细胞的百分比和巨噬细胞M2型标记基因Mrc1,Arg1和Fizz1的mRNA水平,但不影响肿瘤生长以及不改变肿瘤组织TAMs的数量。与对照组相比,吉非替尼显著降低了 CD68,CD206阳性细胞的比例,并且减少了 M2型极化的巨噬细胞在肿瘤组织中的浸润。我们的研究表明,吉非替尼在体内和体外均能有效地抑制巨噬细胞M2型极化并且显著降低Lewis肺癌的转移。因此,我们认为吉非替尼可以通过影响巨噬细胞的生物学特点调控肿瘤转移部位的微环境,从而为吉非替尼抗肿瘤功能阐明了新的机制。本课题的研究揭示了吉非替尼新的作用机制,为提高肺癌治疗效果提供新的思路,在未来可以通过抑制巨噬细胞M2型极化治疗肺癌。肝癌(HCC)与炎症高度相关。在HCC微环境的髓样细胞中,均存在着大量德尔肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和髓源性抑制细胞(MDSC,而且常与不良预后有关。肿瘤相关巨噬细胞TAMs及其启动信号转导通路在肝细胞癌的治疗中是潜在的靶点。在肿瘤环境中MMP-9表达的增加被认为可以通过降解细胞外基质(ECM)和基底膜,释放基质结合生长因子和促肿瘤生长因子从而促进肿瘤的侵袭和血管生成能力。IL-13被确定为诱导巨噬细胞替代型极化的典型细胞因子。为了建立巨噬细胞替代型极化的体外模型,我们在RAW264.7细胞培养体系中加入10ng/ml的IL-13。在实验中,我们根据M2型表面标记物CD206和CD163的表达降低确定拉帕替尼能够显著抑制IL-13所诱导的巨噬细胞M2型极化。有研究表明肿瘤相关巨噬细胞能够分泌MMP-9,不过IL-13诱导的巨噬细胞和MMP-9产生之间的联系却并没有明确的报道。随后,在肝癌细胞中我们发现IL-13可以增加MMP-9产生以及M2型标记基因Arg1,Mrc1,Ym1,ILI0,Fizz1和CCL2的表达增加。有趣的是,在实验中若细胞没有被IL-13活化则拉帕替尼对MMP-9的产生没有影响。拉帕替尼抑制IL-13诱导的RAW264.7巨噬细胞的M2型极化。IL-13信号通路可以激活STAT6的磷酸化,在M2型极化中具有重要的作用。此外,Arg-1的表达被证实是由STAT6决定的。拉帕替尼随着时间的推移显著降低Arg-1的表达。进一步我们通过western blot证实Arg1与Mrc1表达水平的变化。拉帕替尼可以显著地降低IL-13诱导的Mrc1和Arg1的表达。这些体外实验结果表明,拉帕替尼通过STAT6依赖途径显著地抑制IL-13诱导的M2型巨噬细胞极化。PI3K/Akt通路的激活与肿瘤的存活率,侵袭能力和多种肿瘤的不良预后有着密切的联系。我们发现拉帕替尼有效地降低Akt的磷酸化水平。进一步的侵袭实验中,在与给予拉帕替尼作用的RAW264.7条件培养基共孵育后,可以减少肝癌细胞的血管生成以及降低其转移能力。我们考察了拉帕替尼对巨噬细胞和肿瘤细胞相互作用的功能的影响。分别单独或者共同给予IL-13和拉帕替尼作用于巨噬细胞72小时,然后更换为新鲜无血清培养基24小时后,将各组的上清收集起来作为条件培养基。为了排除条件培养基对肿瘤存活的影响,我们将条件培养基作用于HepG2细胞24h,并进行细胞存活分析。结果显示,四个组别之间对肝癌细胞HepG2存活的作用并没有显著差异,均不影响其存活。给予IL-13刺激的巨噬细胞组的条件培养基在24h时显著促进了 HepG2细胞的迁移,而同时给予拉帕替尼合用组的条件培养基则没有这样的现象,同样地,单用拉帕替尼的组也没有此现象。拉帕替尼减少了 RAW264.7细胞或骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)中Arg1的表达。使用骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)证实了拉帕替尼可以下调M2型标志基因Mrc1,Arg1,Ym1,Fizz1,CCL2的mRNA表达水平以及可以减少MMP-9的产生。结果表明,拉帕替尼可能通过调节微环境中巨噬细胞蛋白酶的表达水平以及M2型极化从而抑制肿瘤细胞的侵袭能力。结果还表明,拉帕替尼可能作用于IL-13诱导产生的促肿瘤侵袭以及肿瘤微环境中的巨噬细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。巨噬细胞极化与酪氨酸激酶抑制剂抗肿瘤效果的相关性。将M2型极化尽可能转变为M1型极化会是对抗实体瘤的有效治疗手段。总而言之,靶向肿瘤微环境中的TAMs是未来研究一个方向,而且在未来抑制巨噬细胞M2型极化从而治疗癌症的也将是有效方案。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R73-3

【参考文献】