运动及针刺干预对骨骼肌内质网应激—自噬反应的影响机制研究

发布时间：2017-12-29 15:59

本文关键词：运动及针刺干预对骨骼肌内质网应激—自噬反应的影响机制研究　出处：《北京体育大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:以CRT、FAM134B和LC3的分子作用为切入点,观察大负荷运动后骨骼肌内质网应激-自噬反应的发生情况,并分析内质网功能的变化;观察针刺干预对运动大鼠骨骼肌内质网应激-自噬反应的影响,并分析针刺对内质网功能受损的改善作用;探讨骨骼肌细胞内质网应激-自噬反应的分子机制。方法:以雄性SD大鼠和离体大鼠骨骼肌细胞(L6细胞)为研究对象。研究一将大鼠分为安静对照组和运动组,运动组进行一次持续下坡跑。研究二将大鼠分为安静对照组、单纯运动组、单纯针刺组和运动针刺组,其中运动组和运动针刺组进行一次持续下坡跑,单纯针刺组和运动针刺组施以针刺干预。各组大鼠又按照运动后不同时间点分为0h、12h、24h、48h和72h组,在对应时相取比目鱼肌进行指标测试。使用荧光探针法测定内质网钙离子浓度([Ca~(2+)]ER)、ELISA法测定Ca~(2+)-ATP酶(SERCA)和蛋白二硫键异构酶(PDI)含量;应用Western Blot法检测内质网应激蛋白GRP78、CRT,内质网自噬受体蛋白FAM134B、自噬标志蛋白LC3的表达;采用免疫荧光双染结合激光共聚焦显微镜观测FAM134B与CRT、LC3与CRT的共定位情况;运用免疫胶体金技术对定位于内质网的应激蛋白CRT进行标记,电镜下观察标记CRT的内质网自噬体状态。研究三分为对照组、内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(TG)处理组和内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)处理组,同一时间收取细胞测试各相应指标,并运用免疫共沉淀方法,证实L6细胞内质网应激蛋白CRT与自噬受体蛋白FAM134B、FAM134B与自噬标志蛋白LC3的相互作用。结果:(1)大负荷运动后大鼠骨骼肌[Ca~(2+)]ER急剧下降,SERCA和PDI功能障碍;内质网应激蛋白GRP78、CRT表达上调,峰值出现在运动后即刻;自噬受体蛋白FAM134B和自噬标志蛋白LC3在内质网中表达升高且与CRT共定位增加,峰值出现在运动后12小时;电镜下可见不同阶段的自噬体中聚集CRT的免疫标记,以运动后12小时最为明显。(2)针刺干预可使运动大鼠骨骼肌[Ca~(2+)]ER、SERCA和PDI含量升高;GRP78和CRT蛋白表达相应下调;FAM134B和LC3的转位以及与CRT共定位减少。(3)施加内质网应激诱导剂TG处理后,大鼠骨骼肌细胞内质网钙稳态失衡、功能障碍,CRT表达上调;FAM134B和LC3转位至内质网且与CRT共定位增加;免疫共沉淀结果显示CRT与FAM134B、FAM134B与LC3之间相互作用加强。结论:(1)大负荷运动可诱导骨骼肌内质网钙离子紊乱、功能受损,随即通过CRT、FAM134B和LC3启动内质网应激-自噬反应。(2)运动后针刺可下调CRT蛋白表达,抑制FAM134B和LC3转位,进而通过有效调节内质网应激-自噬反应来缓解骨骼肌内质网功能受损。(3)骨骼肌细胞内质网应激-自噬反应的可能机制为:内质网钙稳态失衡、功能障碍后,CRT蛋白表达上调,FAM134B选择性锚定CRT并招募LC3,三者相互作用协同调控骨骼肌细胞内质网应激-自噬反应。
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【学位授予单位】：北京体育大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R87

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