血浆miRNA与腰椎间盘退变的相关性及补肾壮督方的干预研究
本文关键词：血浆miRNA与腰椎间盘退变的相关性及补肾壮督方的干预研究 出处：《广州中医药大学》2017年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：目的:1.筛选腰椎间盘退变(Lumbar intervertebral disc degeneration,LIDD)患者血浆中差异性表达的miRNA,探讨差异性血浆miRNA是否在LIDD人群中具有特异性表达,是否对LIDD诊断有价值。2.建立大鼠LIDD的动物模型,进一步验证差异性miRNA的表达与LIDD的关系,并检测椎间盘中差异性miRNA靶基因介导的信号转导通路的表达变化。3.通过补肾壮督方干预LIDD大鼠,探讨补肾壮督方对差异性miRNA及其靶基因介导的信号转导通路的表达影响,进一步揭示补肾壮督方延缓LIDD的作用机制。方法:1.临床研究①选取2015年12月一 2016年4月就诊于广州中医药大学第三附属医院脊柱科住院部及门诊的3例LIDD患者作为病例组,同期选取3例年龄和性别相匹配且无LIDD的志愿者作为对照组。抽取LIDD患者和无LIDD志愿者的血浆,进行MicroRNA芯片的筛选。②通过实时荧光定量RT-PCR对MicroRNA芯片筛选出差异表达明显的miRNA进行原位验证,选出与LIDD密切相关的差异表达miRNA。③收集2015年12月一 2016年8月就诊于广州中医药大学第三附属医院脊柱科住院部及门诊的30例LIDD患者作为病例组,同期选取20例年龄和性别相匹配且无LIDD的志愿者作为对照组。根据原位验证的结果,以及文献报道研究,将与LIDD密切相关的miRNA在这50例人群中进行扩大样本验证研究,进一步验证差异miRNA表达与LIDD的特异性。并对有差异性的miRNA进行受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析,使用ROC曲线下面积(AUC)评估它们的诊断价值。2.实验研究选取60只雄性SD大鼠(3月龄),随机分为假手术组、模型组、低剂量中药组、中剂量中药组和高剂量中药组,每组各12只。假手术组:从大鼠的腹部右侧旁正中切开,暴露L4到L6椎间盘后即缝合皮肤。其他组:从大鼠的腹部右侧旁正中切开后,暴露L4到L6椎间盘,并采用纤维环的全层穿刺法建立大鼠LIDD模型。造模第2天,低剂量中药组、中剂量中药组和高剂量中药组分别给予低剂量、中剂量和高剂量的补肾壮督方水煎液灌胃,假手术组和模型组则分别予等容积的生理盐水灌胃。8周后,取大鼠的血浆和L4到L6的椎间盘。用HE染色观察各组椎间盘的退变情况,并根据其退变程度进行病理评分,通过实时荧光定量RT-PCR检测血浆和腰椎间盘中的特异性miRNA的表达,采用蛋白质印迹法和实时荧光定量RT-PCR分析腰椎间盘中特异性miRNA靶基因及其介导的信号转导通路表达变化。结果:1.临床研究①miRNA芯片筛选出LIDD人群中存在23个差异表达的miRNA,其中7个miRNA表达下调,16个miRNA表达上调。②根据MicroRNA芯片结果,对17个差异表达稳定的miRNA进行了原位验证,只有miRNA-4763-3p和miRNA-4767的下调表达差异显著,具有统计学意义(P0.05)。③结合文献报道研究,将miRNA-4763-3p、miRNA-4767和miRNA-125a-5p进行了扩大样本验证研究。miRNA-4767和miRNA-125a-5p的表达显著下调,具有统计学意义(P0.05),miRNA-4763-3p的表达下调则不明显,无统计学差异(P0.05)。④ROC曲线分析显示,miRNA-4767和miRNA-125a-5p是对LIDD诊断有价值的生物标记物(P0.05)。其中 miRNA-4767 AUC值为 0.735,95%置信区间 CI 为:0.591-0.850;miRNA-125a-5p 的 AUC 值为 0.863,95%置信区间 CI 为:0.759-0.967。2.实验研究①各组腰椎间盘HE染色的形态学改变与假手术组比较,模型组的腰椎间盘发生了明显的退变,组织退变评分显著升高,具有统计学意义(P0.05);与模型组相比,低剂量、中剂量、高剂量中药组的腰椎间盘退变均出现了明显改善,组织学退变的评分均显著降低,具有统计学意义(P0.05);补肾壮督方三个中药组之间的组织学退变评分比较亦有统计学差异(P0.05)。②各组血浆中miRNA-125a-5p的表达变化与假手术组比较,模型组血浆中miRNA-125a-5p的表达降低,具有统计学差异(P0.05);与模型组相比,低、中、高剂量中药组血浆中miRNA-125a-5p的表达明显升高,有统计学差异(P0.05);补肾壮督方的三个中药组血浆中miRNA-125a-5p之间的表达比较亦有统计学差异(P0.05)。③各组腰椎间盘组织中miRNA-125a-5p的表达变化与假手术组比较,模型组椎间盘组织中的miRNA-125a-5p表达明显降低,具有统计学差异(P0.05);与模型组相比,低、中、高剂量中药组椎间盘组织中的miRNA-125a-5p表达则明显升高,有统计学差异(P0.05);补肾壮督方的三个中药组椎间盘组织中的miRNA-125a-5p表达之间比较亦有统计学差异(P0.05)。④各组miRNA-125a-5p靶基因TP53INP1及p21、Caspase-3的基因表达变化与假手术组比较,模型组的TP53INP1、p21和caspase-3基因表达都明显升高,具有统计学差异(P0.05);与模型组相比,低、中、高剂量中药组的TP53INP1、p21和caspase-3基因表达都明显降低,有统计学差异(P0.05);补肾壮督方的三个中药组之间比较亦有统计学差异(P0.05)。⑤各组miRNA-125a-5p靶基因TP53INP1及p21、活化的Caspase-3的蛋白表达变化与假手术组比较,模型组的TP53INP1、p21和活化的Caspase-3(Active Caspase-3)蛋白表达都明显升高,具有统计学差异(P0.05);与模型组相比,低、中、高剂量中药组的TP53INP1、p21和caspase-3的基因表达都明显减低,有统计学差异(P0.05);补肾壮督方的三个中药组之间比较亦有统计学差异(P0.05)。结论:1.腰椎间盘退变患者外周循环血浆中存在差异表达的miRNA,血浆miRNA-4767和miRNA-125a-5p在LIDD患者中的表达显著降低。2.血浆miRNA-4767和miRNA-125a-5p对LIDD的诊断具有较好的诊断效能,有望成为腰椎间盘退变精准诊断的新型生物标志物。3.补肾壮督方能够有效的延缓大鼠腰椎间盘退变的病理改变,降低椎间盘退变的病理评分,并且疗效具有一定的剂量依赖性。4.miRNA-125a-5p在腰椎间盘退变的大鼠血浆及退变的椎间盘组织中表达明显降低,而在其靶基因TP53INP1及p21、Caspase-3的表达则明显升高。这表明在LIDD的过程中miRNA-125a-5p及其靶基因TP53INP1介导的通路被激活,miRNA-125a-5p是腰椎间盘退变的一个潜在治疗靶点。5.补肾壮督方能够上调大鼠退变的椎间盘组织及血浆中miRNA-125a-5p的表达,并且下调其 TP53INP1、p21、Caspase-3 的基因及 TP53INP1、p21、活化的 Caspase-3的蛋白表达。其延缓椎间盘退变的作用机理与调控miRNA-125a-5p及其靶基因TP53INP1介导的通路活性变化有关,并且作用效果具有一定的剂量依赖性。
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【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R274.9
【参考文献】
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，本文编号：1351786
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