细胞自噬对内皮祖细胞功能影响的机制研究

发布时间：2017-12-29 20:33

  本文关键词：细胞自噬对内皮祖细胞功能影响的机制研究　出处：《第三军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：研究背景及目的目前研究认为,血管内皮细胞的损伤和功能异常是动脉粥样硬化发生的始动环节,受损内皮细胞的修复对于动脉粥样硬化病变的发生和发展至关重要。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)作为血管内皮细胞的前体细胞,是受损内皮修复的主要参与者。EPCs主要存储于骨髓、脾脏等器官,在生理或病理因素刺激下,EPCs从骨髓、脾脏等动员,迁移到外周血并归巢至损伤血管附近,参与受损内皮的修复。然而,传统方式以EPCs移植为基础的细胞治疗,由于受循环中多种心血管危险因素的影响,移植后的EPCs生物学功能受到损害,增殖能力降低,生存能力减弱,局限了细胞治疗向临床的转化。因此,寻求提高应激条件下EPCs的生存能力,促进EPCs增殖,改善受损内皮的修复,对有效防治动脉粥样硬化性心血管疾病具有重要意义。自噬(autophagy)是真核细胞特有的降解长寿命蛋白和受损细胞器的主要途径,也是细胞适应不利环境,维持稳态,促进生存的重要方式。细胞自噬受多种因素的影响,目前研究认为细胞内钙稳态的失衡是影响自噬水平的重要因素;然而由于胞内外钙信号的复杂变化,钙离子对细胞自噬调控的信号通路及自噬水平的变化趋势尚存争议。EPCs作为非兴奋细胞,钙库操纵性钙内流(store operated calcium entry,SOCE)是其主要钙内流的方式,由钙库操纵性钙通道(store operated calcium channels,SOCC)复合体介导。本实验室前期研究发现,EPCs上不仅普遍表达SOCC复合体组成蛋白STIM1、TRPC1和ORAI1,并且与EPCs的众多生物学功能密切相关。因此,这提示我们SOCC复合体介导的钙内流可能参与了EPCs自噬水平的调控,而通过对EPCs自噬水平的调节将有助于增强EPCs在应激条件下的生存能力,提高移植后循环中EPCs的生存效率,进一步改善受损内皮的修复。基于以上原因,本研究利用动脉粥样硬化模型小鼠及体外模拟动脉粥样硬化危险因素-氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL),探讨SOCE介导的细胞自噬在EPCs生物学功能中的作用及机制,寻求提高细胞自噬的临床药物,为提高EPCs移植效率提供理论基础和依据。方法1.动脉粥样硬化模型小鼠EPCs增殖、迁移能力及和自噬水平的变化1.1动脉粥样硬化模型小鼠建立及EPCs的培养、鉴定Apo E-/-小鼠饲以高脂饮食(21%脂肪、0.15%胆固醇),分别于12周和16周收获动脉粥样硬化模型小鼠,取小鼠主动脉进行油红O染色验证动脉粥样硬化模型。野生型小鼠采用Apo E-/-同源的C57BL/6小鼠作为对照。通过密度梯度离心方法分离获得小鼠骨髓源性EPCs,培养在人纤连蛋白铺板后的培养瓶或培养皿中。1.2流式细胞仪及荧光多标方法鉴定EPCs。1.2.1分别用PE标记抗小鼠CD133抗体、Per CP标记抗小鼠的CD34抗体,APC标记抗小鼠的VEGFR-2抗体避光孵育1小时,以同型抗体为对照,孵育后的细胞用流式细胞仪检测细胞表面VEGFR-2、CD34、CD133抗原的表达;1.2.2采用FITC-UEA-I、Di I-ac LDL和DAPI分别对分离后的细胞染色后,采用激光共聚焦显微镜观察,显示绿色荧光的为UEA-I阳性细胞,红色荧光的为Di I-ac LDL阳性细胞,蓝色荧光则是细胞核,三染阳性细胞为正在分化的EPCs。1.3动脉粥样硬化模型小鼠EPCs增殖和迁移功能的变化1.3.1采用显微镜下计数和CCK-8检测分析EPCs增殖能力。1.3.2利用迁移小室实验检测EPCs迁移能力的变化。1.4动脉粥样硬化模型小鼠EPCs的自噬水平的变化1.4.1分离培养7天后的EPCs,以Western Blot分析各组自噬标志蛋白LC3II/LC3I、p62的表达变化。1.4.2向分离培养7天后的EPCs转染GFP-m RFP-LC3腺病毒标记LC3约4小时,激光共聚焦下观察并计数各组自噬体与自噬溶酶体的数量,评价细胞自噬水平。2.ox-LDL对大鼠EPCs增殖、迁移能力,SOCE及细胞自噬水平的影响2.1流式细胞仪及荧光多标方法鉴定。2.1.1分别用PE标记抗大鼠CD133抗体、Per CP标记抗大鼠的CD34抗体,APC标记抗大鼠的VEGFR-2抗体避光孵育1小时,以同型抗体为对照,孵育后的细胞用流式细胞仪检测细胞表面VEGFR-2、CD34、CD133抗原的表达;2.1.2采用FITC-UEA-I、Di I-ac LDL和DAPI分别对分离后的细胞染色后,采用激光共聚焦显微镜观察,显示绿色荧光的为UEA-I阳性细胞,红色荧光的为Di I-ac LDL阳性细胞,蓝色荧光则是细胞核,三染阳性细胞为正在分化的EPCs。2.2.1分离获得正常大鼠EPCs,体外培养7天后,我们采用不同浓度ox-LDL培养6、12和24小时后,通过CCK-8检测EPCs增殖能力。2.2.2 CCK-8检测分析EPCs增殖能力。2.2.3迁移小室实验检测EPCs迁移能力的变化。2.3 ox-LDL对EPCs的SOCE的影响2.3.1分离获得正常大鼠EPCs,暴露于含有0-100μg/ml ox-LDL培养基中12小时,再孵育钙离子探针Fluo3-AM,并在激光共聚焦显微镜下观察荧光强度,通过公式计算胞内钙浓度。[Ca2+]i(n M)= Kd ×(F-Fmin)/(Fmax-F)(Kd:室温下解离常数)2.3.2分离获得正常大鼠EPCs,孵育钙离子探针Fluo3-AM,并在激光共聚焦显微镜下观察不同浓度ox-LDL瞬时刺激EPCs后,细胞内钙流的变化;5分钟后再向无钙的细胞外液中加入2 m M钙离子,共聚焦显微镜下进一步动态观察细胞内钙流变化。2.3.3 Western Blot检测ox-LDL暴露后EPCs内SOCC组成蛋白STIM1的表达变化。2.3.4分离获得正常大鼠EPCs,利用慢病毒沉默STIM1后,暴露于60μg/ml ox-LDL培养基中12小时,再孵育钙离子探针Fluo3-AM,并在激光共聚焦显微镜下观察荧光强度,通过公式计算胞内钙浓度。2.3.5分离获得正常大鼠EPCs,慢病毒转染的方式稳定沉默SOCC复合体关键蛋白STIM1,2天后再孵育钙离子探针Fluo-3-AM,在激光共聚焦显微镜下,观察60μg/ml ox-LDL瞬时刺激EPCs后,细胞内钙流的变化;5分钟后再向无钙的细胞外液中加入2 m M钙离子,共聚焦显微镜下进一步动态观察细胞内钙流的变化。2.3.6分离获得正常大鼠EPCs,孵育钙离子探针Fluo3-AM,在激光共聚焦显微镜下,动态观察60μg/ml ox-LDL瞬时刺激EPCs后,细胞内钙流的变化;5分钟后再向无钙的细胞外液中加入2 m M钙离子,30秒后再加入50μM SOCE特异性抑制剂2-APB,共聚焦显微镜下进一步动态观察细胞内钙流的变化。2.4 ox-LDL对EPCs自噬水平影响2.4.1分离获得正常大鼠EPCs,用不同浓度ox-LDL培养EPCs 6、12、18和24小时后,提取蛋白后分别行Western Blot检测自噬标志蛋白LC3II/LC3I和p62表达水平。2.4.2 60μg/ml ox-LDL培养EPCs 12小时后转染GFP-m RFP-LC3腺病毒标记LC3约4小时,激光共聚焦下观察并计数各组自噬体与自噬溶酶体的数量,评价细胞自噬2.2 ox-LDL对EPCs增殖、迁移能力的影响水平。3.SOCE-CAMKK2-MTOR介导的细胞自噬与EPCs功能的关系3.1 ox-LDL激活SOCE-CAMKK2-MTOR信号通路促进EPCs自噬的发生3.1.1分离培养7天后的EPCs,分别用BAPTA-AM 20μM或EGTA 10 m M预处理20分钟后,再暴露于60μg/ml ox-LDL 12小时,Western Blots检测细胞内LC3II/LC3I的表达。3.1.2分离培养7天后的EPCs,分别用细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM和细胞外钙离子螯合剂EGTA处理20分钟,再暴露于60μg/ml ox-LDL 12小时,然后再转染GFP-m RFP-LC3腺病毒标记LC3约4小时,激光共聚焦下观察并计数各组自噬体与自噬溶酶体的数量,评价细胞自噬水平。3.1.3分离培养7天后的EPCs暴露于60μg/ml ox-LDL 12小时后,提取总蛋白Western Blot分别检测p-CAMKK2、CAMKK2、p-AMPK、AMPK、p-MTOR、MTOR、p-P70S6K和P70S6K蛋白表达情况。3.1.4利用CAMKK2特异性抑制剂STO-609预处理后的EPCs,再将EPCs暴露于60μg/ml ox-LDL 12小时后,Western Blots检测LC3II/LC3I、p-CAMKK2、CAMKK2、p-AMPK、AMPK、p-MTOR、MTOR、p-P70S6K和P70S6K的表达。3.1.5构建STIM1沉默慢病毒,转染培养5天的EPCs,抑制STIM1表达,再将EPCs暴露于含有60μg/ml ox-LDL培养基中12小时,Western Blot检测LC3II/LC3I、p-CAMKK2和CAMKK2的表达。3.2细胞自噬与EPCs功能的关系3.2.1分离培养后的EPCs接种于E-plates培养板上,24小时后转染慢病毒沉默自噬关键蛋白ATG7,转染48小时后再将EPCs暴露于含有60μg/ml ox-LDL的培养基中,细胞实时动态分析记录仪(Real-time cellular analyzer,RTCA)动态记录自噬抑制后EPCs增殖能力。3.2.2分离培养5天后的EPCs转染慢病毒沉默自噬关键蛋白ATG7,48小时后暴露于含有60μg/ml ox-LDL培养基中,CCK-8分析细胞增殖能力。3.2.3分离培养5天后的EPCs转染慢病毒沉默自噬关键蛋白ATG7,48小时后暴露于含有60μg/ml ox-LDL培养基中,Transwell分析细胞迁移能力。3.2.4分离培养后的EPCs接种于E-plates培养板上,利用自噬特异性抑制剂3-MA处理细胞后再暴露于含有60μg/ml ox-LDL培养基中,RTCA动态记录自噬抑制后EPCs增殖能力。3.2.5使用自噬特异性抑制剂3-MA预处理培养7天后的EPCs,再暴露于含有60μg/ml ox-LDL培养基中12小时,CCK-8分析细胞增殖能力。3.2.6使用自噬特异性抑制剂3-MA预处理培养7天后的EPCs,再暴露于含有60μg/ml ox-LDL培养基中12小时,Transwell分析细胞迁移能力。4.匹伐他汀通过调节细胞自噬影响EPCs功能4.1 PTV对EPCs增殖、迁移能力的影响4.1.1分离培养7天后的EPCs,在含有0.1μM PTV的培养基中培养,采用CCK-8分析细胞增殖能力的变化。4.1.2分离培养7天后的EPCs,在含有0.1μM PTV的培养基中培养,采用迁移小室实验分析细胞迁移能力的变化。4.2 PTV对EPCs自噬水平的影响4.2.1在含有0.1μM PTV的培养基中培养后,Western Blot检测自噬关键蛋白LC3II/LC3I和p62表达差异。4.2.2在含有0.1μM PTV的培养基中培养后的EPCs,使用GFP-m RFP-LC3腺病毒转染标记后,在激光共聚焦显微镜下观察自噬体与自噬溶酶体的变化。4.3 PTV通过激活自噬改善EPCs增殖、迁移能力4.3.1利用自噬特异性抑制剂3-MA预处理后,再暴露于含有0.1μM PTV的培养基中,CCK-8分析细胞增殖能力的变化。4.3.2利用自噬特异性抑制剂3-MA预处理后,再暴露于含有0.1μM PTV的培养基中,迁移小室实验观察EPCs迁移能力的变化。4.3.3使用慢病毒转染的方式沉默自噬关键蛋白ATG7,48小时后再暴露于含有0.1μM PTV的培养基中,CCK-8分析细胞增殖能力的变化。4.3.4使用慢病毒转染的方式沉默自噬关键蛋白ATG7,48小时后再暴露于含有0.1μM PTV的培养基中,迁移小室实验观察EPCs迁移能力的变化。结果1.动脉粥样硬化模型小鼠EPCs增殖、迁移能力及自噬水平的变化1.1动脉粥样硬化模型小鼠建立及EPCs的培养、鉴定成功构建动脉粥样硬化小鼠模型,在小鼠主动脉处可见明显的脂质斑块的形成。成功分离、培养及鉴定EPCs,分离第1日细胞可见呈圆形的贴壁状态,第三日可见细胞呈铺路石样改变,第五日可见细胞呈梭形、纺锤形改变,并呈线样排列。流式细胞仪分析后显示大部分细胞为VEGFR2、CD133、CD34阳性细胞。荧光染色后显示大部分细胞同时表达内皮细胞特异性标记物(UEA)并具有结合LDL的能力。1.2动脉粥样硬化模型小鼠EPCs增殖和迁移功能的变化利用CCK-8分析动脉粥样硬化模型小鼠EPCs增殖活性,可见高脂饮食12周后EPCs增殖能力显著降低,高脂饮食16周后EPCs增殖能力进一步降低。Transwell结果提示高脂饮食12周后EPCs迁移能力降低,高脂饮食16周后进一步降低。1.3动脉粥样硬化模型小鼠EPCs的自噬水平的变化分离培养动脉粥样硬化模型小鼠EPCs 7天后,检测胞内自噬关键蛋白表达,可见随着动脉粥样硬化进展LC3II/LC3I表达比例降低,p62表达增加,激光共聚焦显微镜下自噬体和自噬溶酶体的数量减少。2.ox-LDL对EPCs增殖、迁移能力,SOCE及细胞自噬水平的影响2.1在观察到动脉粥样硬化模型小鼠EPCs生物学功能和自噬水平的改变后,我们采用动脉粥样硬化危险因素ox-LDL体外模拟动脉粥样硬化形成微环境。通过CCK-8分析我们发现ox-LDL呈剂量和时间依赖性降低EPCs增殖能力。在迁移小室实验中,ox-LDL同样显著降低EPCs迁移能力。2.2在检测到ox-LDL对EPCs增殖、迁移能力的影响之后,我们检测EPCs内钙浓度,发现ox-LDL处理后,EPCs内钙浓度显著增加,ox-LDL是否通过SOCE引起胞内钙浓度变化的,我们进一步在激光共聚焦下观察到ox-LDL瞬时刺激EPCs后引起了胞内钙库的释放,5分钟后再向无钙的细胞外液中加入2 m M钙离子,进一步引起了胞内钙浓度的增加,胞内钙的再次增加是通过SOCE介导,并呈现剂量依赖性。我们根据公式计算得到细胞内实际钙离子浓度,我们证实ox-LDL激活SOCE引起EPCs内钙水平增加。此外,STIM1作为SOCC重要组成蛋白,STIM1是否参与ox-LDL诱导的SOCE,我们检测ox-LDL处理后STIM1表达,发现60和100μg/ml ox-LDL暴露12小时后显著增强STIM1表达。2.3根据以上结果我们确定60μg/ml为后续实验组ox-LDL浓度,我们采用慢病毒稳定转染的方式沉默SOCC复合体关键蛋白STIM1,随后再用60μg/ml ox-LDL瞬时刺激EPCs,在共聚焦显微镜下可见在STIM1沉默组ox-LDL引起胞内钙库释放的钙振幅显著减弱,同时在细胞外液中补充2 m M浓度的钙离子后,STIM1沉默组的SOCE振幅依然显著低于对照组。我们在补充外液钙离子前30秒用SOCE特异性抑制剂50μM 2-APB预处理细胞,结果显示2-APB组能够显著抑制ox-LDL引起的SOCE,进一步证实ox-LDL激活SOCE。2.4随后我们检测ox-LDL对EPCs自噬水平的影响,发现ox-LDL呈剂量-时间依赖性显著增加EPCs内LC3II/LC3I比例,结果显示ox-LDL增强EPCs自噬水平。结合自噬体和溶酶体特异性阻断剂BAFA1和CQ,我们在激光共聚焦显微镜下发现ox-LDL促进EPCs自噬流。3.SOCE-CAMKK2-MTOR介导的细胞自噬与EPCs功能的关系3.1细胞内钙离子螯合剂(BAPTA-AM)和细胞外钙离子螯合剂(EGTA)预处理后显著逆转ox-LDL引起的LC3II/LC3I增加(p0.01),同时共聚焦显微镜下也显示细胞内外钙离子螯合剂预处理后,减少了ox-LDL引起的自噬体和自噬溶酶体的增加(p0.01)。3.2随后我们探究ox-LDL是如何激活EPCs自噬的,发现60μg/ml ox-LDL处理EPCs 12小时后,增加了CAMKK2(p0.01)和AMPK(p0.01)磷酸化水平,降低了MTOR(p0.01)和P70S6K(p0.01)的磷酸化水平。采用CAMKK2特异性抑制剂预处理后,在显著降低ox-LDL引起的LC3II/LC3I(p0.01)比例的同时,逆转了ox-LDL对AMPK(p0.01)磷酸化,增加了MTOR(p0.01)和P70S6K(p0.01)的磷酸化。此外,通过慢病毒稳定转染沉默STIM1后,ox-LDL上调的LC3II/LC3I和CAMKK2磷酸化被逆转。以上结果证实,ox-LDL通过SOCE-CAMKK2-MTOR通路激活EPCs自噬。3.3为进一步探究自噬与EPCs功能的关系,我们发现沉默EPCs自噬后,RTCA和CCK-8结果显示ox-LDL进一步抑制EPCs增殖能力(p0.01);此外,采用自噬抑制剂3-MA预处理后再暴露于ox-LDL,EPCs增殖能力也进一步抑制(p0.01)。该结果证实ox-LDL激活的自噬保护应激环境下EPCs增殖能力。4.匹伐他汀通过调节自噬影响EPCs功能我们在寻求提高EPCs功能的药物中发现,匹伐他汀(Pitavastatin,PTV)显著提高EPCs增殖和迁移能力的同时上调了自噬关键蛋白LC3II/LC3I的比例,降低了p62的表达,激活了EPCs自噬。当我们采用慢病毒沉默自噬后,PTV改善EPCs增殖和迁移能力被逆转;此外,自噬抑制剂3-MA预处理EPCs后,PTV改善EPCs增殖和迁移的能力同样被逆转。以上结果证明,PTV通过增强EPCs自噬的方式改善EPCs功能。结论1.动脉粥样硬化模型小鼠中EPCs增殖、迁移能力减弱,自噬水平降低;2.体外ox-LDL模拟动脉粥样硬化形成微环境,EPCs增殖、能力减弱,SOCE被激活,自噬水平增强;3.体外ox-LDL培养EPCs,激活SOCE-CAMKK2-MTOR信号通路上调EPCs自噬水平,自噬的激活保护应激环境下EPCs增殖、迁移能力;4.PTV通过调节细胞自噬水平,改善EPCs生物学功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.5

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本文编号：1351813